研究表明,卵巢恶性肿瘤占女性生殖道恶性肿瘤的22.9％,近年来卵巢癌的发病率呈上升的趋势,40年来增加了3倍。在妇女生殖道癌中,卵巢癌是造成死亡原因最高的,也是对女性生命及健康威胁最大的一种疾病。虽然卵巢癌手术和化学疗法有了长足的进展,但其预后仍差,尤其是晚期患者的5年生存率仍无明显改善。寻找治疗卵巢癌的新方法仍是一任重而道远的任务。　　 肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)是近期国内外学者们发现的重要抑癌基因之一,DLC-1在人类多种组织中均有表达,而在多种肿瘤组织中通常呈低表达或不表达。FAK即粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK),是一种酪氨酸激酶,在粘着斑上被激活,在人类多种肿瘤中FAK的表达增加或发生磷酸化,这种变化可导致侵袭性肿瘤细胞的表达和转移机会增加,从而促进肿瘤的发生和转移。　　 FAK和DLC-1在卵巢癌研究中的新发现和在肿瘤中所起的重要作用,使其作为卵巢肿瘤的两个有潜在价值的候选基因成为可能,期望二者可用于卵巢癌的早期诊断、预后判断等,有望成为卵巢癌治疗的新靶点。国外学者Tai Young Kim等的研究已经发现在肝癌细胞中DLC-1表达可引起FAK的去磷酸化,能导致FAK的失活,阻止黏着斑的形成,降低肿瘤细胞的黏附性,使肿瘤细胞凋亡,起到抑制肿瘤发生的作用。故我们的前期实验研究选择了FAK和DLC-1为研究对象,研究它们在卵巢癌中的发病机制,实验中我们研究了单独表达DLC-1基因对卵巢癌OVCAR-3细胞的影响,其中包括DLC-1对FAK、JAN等的影响,关于DLC-1、FAK基因双重作用对卵巢癌影响的研究尚未见报道。　　 目前常用的一种新的肿瘤基因治疗方法是基因转染技术,该方法能够在基因水平上纠正异常细胞的遗传缺陷,从最根本上改变癌细胞的遗传性。RNA干扰技术(RNAintering,siRNA或RNAi)是近期发现的一种高效而又特异性强的基FAK对OVCAR-3细胞凋亡的影响o　　 4.应用Western-blotting方法观察干预DLC-1、FAK对ERK、pERK蛋白表达及ERK磷酸化水平的影响。　　 5.通过体内裸鼠移植瘤实验测定干预DLC-1、FAK表达对OVCAR-3移植瘤形成和生长的影响。　　 统计学方法　　 应用SPSS13.0统计软件进行分析处理所有实验数据,计量资料用-x±s表示,结果采用t检验、u检验和单因素方差(One-wayANOVA)分析;采用X2检验和校正X2检验进行统计学处理计数资料;Spearman等级相关分析相关性资料,α=0.05作为检验水准。　　 结果　　 第一部分　　 1.通过免疫组化方法发现DLC-1蛋白在正常卵巢组织中的阳性表达率明显高于卵巢上皮癌组织;p-FAK蛋白在卵巢上皮癌组织的阳性表达率明显高于正常卵巢组织中,差异有统计学意义(P=0.000)。　　 2.DLC-1蛋白在有腹水、淋巴结转移和手术-病理分期晚的卵巢上皮性癌患者中低表达或表达缺失,p-FAK蛋白在有腹水、淋巴结转移和组织学分级高的卵巢上皮性癌患者中高表达。　　 3.DLC-1阳性患者的5年生存率明显高于p-FAK阳性的患者(p=0.009)。　　 第二部分　　 1.构建出FAK基因的siRNA载体重组子、DLC-1基因表达载体重组子、对FAK基因和DLC-1基因共同作用的载体重组子。　　 2.得到沉默FAK基因的OVCAR-3转染细胞、表达DLC-1基因的OVCAR-3转染细胞和沉默FAK同时表达DLC-1的OVCAR-3转染细胞。　　 第三部分　　 1.调控后的DLC-1和FAK对OVCAR-3细胞增殖、黏附的影响　　 1.1 FCM实验结果:沉默FAK基因或/和增加DLC-1基因表达均可减少S期和G2/M期细胞比例,增加G0/G1期细胞比例,且表达DLC-1同时沉默FAK表达(双作用组)的效果更显著,与单独沉默FAK基因或单一增加DLC-1基因组相比,差异具有显著性(p＜0.01)。　　 1.2 CCK-8试剂绘制细胞生长曲线结果:沉默卵巢癌OVCAR-3细胞FAK基因或/和增加DLC-1基因表达,可以降低卵巢癌OVCAR-3细胞的生长速度,双作用组抑制效果更佳,与单独增加DLC-1基因组相比,差异具有显著性(p＜0.01),但与单一沉默FAK基因组相比,差异无显著性(p＞0.05)。　　 1.3细胞基质黏附实验结果:单一高表达DLC-1基因,对OVCAR-3细胞与基质胶黏着、纤维粘连蛋白黏着的吸光度值的影响不大;高表达DLC-1基因同时沉默FAK基因表达组、单一沉默FAK表达组均可降低卵巢癌OVCAR-3细胞与基质胶黏着、纤维粘连蛋白黏着的吸光度值,与单独沉默FAK组相比,双作用组的效果更显著(p＜0.001)。　　 2.调控后的FAK和DLC-1对OVCAR-3细胞的侵袭能力影响　　 2.1通过Transwell实验观察细胞体外侵袭能力,结果显示:增加DLC-1基因表达或/和沉默FAK基因表达均可显著降低OVCAR-3细胞穿透Matrigel能力,且双作用组的效果更显著,与单一沉默FAK基因或单一增加DLC-1基因组相比,差异具有显著性(p＜0.05)。　　 2.2用RT-PCR方法检测MMP-2、MMP-9、TMP1 mRNA表达水平,得到如下结果:　　 单一高表达DLC-1基因,对MMP-2和TIMP1 mRNA相对表达量作用不明显,表达DLC-1同时沉默FAK表达和单一沉默FAK表达,均可显著降低OVCAR-3细胞MMP-2 mRNA相对表达量、增加TIMP1 mRNA相对表达量,双作用组的效果更显著,与单一沉默FAK表达组相比,差异具有显著性(p＜0.05)。　　 表达DLC-1和/或沉默FAK表达均可显著降低OVCAR-3细胞MMP-9mRNA相对表达量,双作用组的效果更显著,与单一沉默FAK基因或单一增加DLC-1基因组相比,差异具有显著性(p＜0.05)。　　 3.调控后的DLC-1和FAK对OVCAR-3细胞凋亡的影响　　 3.1 FCM检测细胞凋亡结果:在卵巢癌OVCAR-3细胞中沉默FAK基因表达或/和增加DLC-1基因表达,可以提高卵巢癌OVCAR-3细胞凋亡率,促使其发生凋亡,其中以双作用的促凋亡效果更佳,与单一沉默FAK基因组或单一增加DLC-1基因组相比,G2/M期细胞比例明显减少,差异具有显著性(p＜0.01)。　　 3.2通过ELISA测定细胞Caspase-3、9的活性发现:在卵巢癌OVCAR-3细胞中沉默FAK基因表达或/和增加DLC-1基因表达,可以提高卵巢癌OVCAR-3细胞中Caspase-3和Caspase-9蛋白酶活性,其中以双作用组的作用最强,与单一沉默FAK基因组或单一增加DLC-1基因表达组相比,差异具有显著性(p＜0.05)。　　 4.调控后的FAK和DLC-1对OVCAR-3细胞中ERK蛋白、pERK蛋白及其磷酸化水平的影响　　 应用western-blot方法检测发现:表达DLC-1基因或/和沉默FAK基因表达均可降低OVCAR-3细胞中ERK、pERK蛋白,双作用组的效果最强(p＜0.05);单独高表达DLC-1基因,对ERK磷酸化水平无明显影响,双作用组、沉默FAK组均可降低OVCAR-3细胞中ERK磷酸化水平,与沉默FAK组相比,双作用组的作用更强(p＜0.05)。　　 5.调控后的DLC-1和FAK对裸鼠移植瘤实验的影响　　 在卵巢癌OVCAR-3细胞中沉默FAK基因或/和增加DLC-1基因表达,(1)可以减小裸鼠肿瘤的体积,其中以双作用组的抑制作用最强,与单一沉默FAK基因组或单一表达DLC-1基因组相比,差异具有显著性(p＜0.001);)(2)可以减小裸鼠肿瘤的重量,其中以双作用组的抑制作用最强,与单一沉默FAK基因组或单一表达DLC-1基因组相比,差异具有显著性(p＜0.002)。　　 结论　　 第一部分　　 1.DLC-1蛋白在卵巢上皮癌组织中低表达或不表达缺失,在卵巢上皮性癌组织中p-FAK蛋白强表达,提示二者有可能可作为卵巢上皮性癌的早期诊断指标。　　 2.DLC-1蛋白的阳性表达与卵巢癌的腹水形成、淋巴结转移和手术-病理分期有关,与卵巢癌的组织学分级无关;p-FAK蛋白的阳性表达与卵巢癌的腹水形成、淋巴结转移和组织学分级密切相关,与卵巢癌的手术.病理分期无关。说明二者与卵巢癌的发生、转移、浸润有关。　　 3.DLC-1阳性患者的5年生存率明显高于p-FAK阳性的患者,提示二者与卵巢癌患者预后有关。　　 第二部分　　 构建出针对FAK基因的三个siRNA重组载体,筛选得到有效沉默FAK基因的OVCAR-3细胞株、高表达DLC-1基因的OVCAR-3细胞株及高表达DLC-1基因同时沉默FAK基因表达的双作用OVCAR-3细胞株。　　 第三部分　　 通过体外实验证明在卵巢癌细胞内单一高效表达DLC-1基因或/和单一沉默FAK.基因表达,可抑制卵巢癌细胞OVCAR-3的增殖、降低侵袭能力、促进其调亡,并降低ERK的磷酸化水平,提示高表达DLC-1或/和沉默FAK表达,可减少肿瘤的发生和转移。虽然单一高效表达DLC-1基因对OVCAR-3细胞黏附能力、OVCAR-3中MMP-2、TIMP1 mRNA相对表达量及ERK磷酸化水平无明显影响,但与沉默FAK基因联合后,均可起到显著作用,且双作用组效果优于单一沉默FAK基因组。　　 通过体内实验证实在卵巢癌细胞内高表达DLC-1、沉默FAK,可有效抑制卵巢癌细胞在裸鼠体内的成瘤和生长,双作用组效果最好。