细胞凋亡在神经系统发育过程中是一个重要的过程。在神经系统发育成熟以前，大概有50％的细胞发生凋亡。但是最近研究表明，凋亡过早是许多神经退行性疾病如帕金森氏病（Parkinson's Disease，PD）和老年性痴呆症（Alzheimer's Disease，AD）的发病机制，因此，阐明神经元凋亡的信号转导机制对治疗退行性疾病具有重要意义。 撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡模型是研究神经元信号转导经典、常用的细胞模型之一，在此模型中，线粒体依赖的凋亡通路起着关键作用。即细胞受凋亡刺激后，经一系列信号转导激活Bcl—2家族促凋亡蛋白，使这些蛋白从胞浆中转移到线粒体，多聚化后形成孔道，使线粒体膜通透性增加，释放细胞色素c等因子，进而激活caspase家族蛋白，最终引起细胞凋亡。发现线粒体转位的关键蛋白质并阐明其转位机制，有助于进一步揭示神经元凋亡的本质。 Bim（Bcl—2 Interacting Medicator of cell death，Bim），是Bcl—2家族重要的促凋亡蛋白，多数细胞内主要有三个亚型蛋白表达：Bim EL、Bim L和Bim S，小脑颗粒神经元Bim EL为主。除转录翻译上调外，Bim的线粒体转位是其介导凋亡的重要机制。最近，我们观察到，在撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时，Bim蛋白上调，且在细胞内呈现局部聚集的现象，提示Bim可能发生线粒体转位。因此，本课题拟阐明：小脑颗粒神经元凋亡时，Bim是否发生线粒体转位？如果Bim发生了线粒体转位，是什么机制介导的？ 为明确小脑颗粒神经元凋亡时Bim细胞内呈现局部聚集现象是否是因为发生线粒体转位而引起，我们采用特异的线粒体荧光染料MitoTracker及Bim抗体分别标记线粒体及Bim，分析两者的共定位系数。结果表明：凋亡时，Bim与线粒体的共定位系数增加，说明在撤钾诱导的CGN凋亡模型中Bim发生了线粒体转位。 进一步，我们寻找凋亡时介导Bim线粒体转位的上游信号。Bim在生理状态下主要与动力蛋白结合而不能定位于线粒体。采用生物信息学方法对Bim的氨基酸序列进行分析，发现在与动力蛋白轻链DLC1结合的关键区域中，有一段序列符合GSK—3底物模序，且该序列在不同种属间相对保守。提示Bim的线粒体转位可能是由GSK—3介导的。 GSK—3（glycogen synthase kinase—3）是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，包含两个亚型：GSK3α and GSK3β。GSK3α的第21位丝氨酸和GSK3β的第9位丝氨酸被上游的激酶磷酸化后，GSK—3的活性降低。在撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时，此位点的磷酸化水平降低，GSK—3活性增强。通过GSK—3抑制剂抑制GSK—3的激酶活性，可以有效地保护神经元，但神经元凋亡时GSK—3的底物尚不明确，各种证据表明是通过破坏线粒体引起的凋亡，这也为GSK—3介导Bim线粒体转位提供了一定的理论基础。 为了说明GSK—3与Bim线粒体转位的关系，我们在撤钾处理时加入GSK—3的抑制剂，再分析Bim和线粒体的共定位系数。结果显示：GSK—3的抑制剂CT99021和SB415286抑制了Bim的线粒体转位。进一步为了排除GSK—3抑制剂的非特异作用，我们设计了GSK—3的小分子干扰片段。与对照片段相比，GSK—3的小分子干扰片段有效的抑制了凋亡时Bim的线粒体转位。以上结果初步表明，Bim的线粒体转位可能是由GSK—3介导的。 综上所述，本课题首次观察到了在小脑颗粒神经元撤钾凋亡模型中，Bim发生线粒体转位，进一步我们通过免疫细胞化学方法初步表明Bim的线粒体转位可能是由GSK—3介导的，这对进一步研究Bim在神经元中的作用具有重要的理论指导意义。 结论： 1.撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时，Bim发生了线粒体转位 2.实验结果初步表明：Bim线粒体转位可能是由GSK—3介导