吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone,PQQ）是一种热稳定的小分子水溶性化合物,是新近发现的继烟酰胺核苷酸（NAD）和黄素核苷酸（FAD）后第三类氧化还原酶的辅酶。大量研究表明,PQQ具有抗氧化、抗辐射、促进认知、增强体能等多种生理功能,在医药保健、认知疾病防治等方面有广阔的应用前景。化学合成法步骤多、污染大、成本高,生物合成被认为是最有前景的生产路线。几乎所有生物体内都可以检测到PQQ的存在,然而迄今已知只有部分革兰氏阴性菌才可以合成PQQ,其中甲基营养菌合成PQQ的水平最高。目前,国内外关于PQQ生物合成的研究报道并不多,对不同PQQ产生菌的序列分析显示,PQQ合成基因包括pqq ABCDEFG,其中pqq A编码的小肽被认为是PQQ合成的前体,Pqq C已被确认负责催化PQQ合成的最后一步,PQQ生物合成途径尚未完全阐明,PQQ合成调控研究报道更少。本实验室从土壤中筛选得到PQQ产生菌食葡萄糖食甲基菌MP688（Methylovorus glucosetrophus）,经过多轮反复诱变得到高产菌株J1-1和S17-19,建立了国际先进乃至领先的PQQ发酵生产工艺。MP688全基因组序列分析发现,PQQ合成基因包括pqq ABCDE和pqq FG2个基因簇以及4个散在的单拷贝pqq A基因。在PQQ发酵工艺优化过程中,发现PQQ合成受到某种因素的调控,当菌体生长迅速时,PQQ合成水平低,当菌体生长缓慢时,PQQ合成水平高。阐明PQQ生物合成的调控机制,对于指导发酵工艺控制以及菌种的遗传改良具有重要意义。在实验室前期工作中,通过实时荧光定量PCR分析了不同条件下PQQ合成基因簇中各基因的转录情况,发现无论是诱变得到的高产菌株还是慢长高产条件下的菌体,PQQ合成与PQQ合成基因的高水平转录存在很大的相关性,提示PQQ的生物合成调控存在转录水平的调控。本课题的目的是从转录水平上研究PQQ合成的调控机制。一方面采用各种方法寻找调控的靶基因及调控基因,包括快长低产和慢长高产以及不同碳源培养下菌体的转录组分析、高产突变株S17-19的基因组重测序、Tn5诱变筛选PQQ合成缺陷株并进行基因定位等等。另一方面分离鉴定参与调控的环境因子或信号分子,明确调控类型,再以此为线索寻找调控基因。对于确定的候选基因通过细菌单杂交、基因敲除、基因回补、基因过表达等方法进一步分析基因与PQQ合成的关系,进而研究调控机制。通过对碳源的考察,发现PQQ产生菌可以利用的碳源并不多,其中在分别以甲醇和果糖为碳源的培养基中菌体生长和PQQ合成水平存在显著差异。通过发酵试验,确定了甲醇、果糖的最适工作浓度均为4g/L,选择产量差异最明显的S17-19,进行了不同碳源条件下转录组分析。对转录水平差异较大的mpq1438等进行了敲除,分析了基因缺失对PQQ合成的影响。对野生型菌株MP688及高产菌株S17-19基因组进行了重测序,发现了46个突变位点,包括5个Indel位点和41个SNP位点。对差异位点进行分析,找出了8个氨基酸序列发生变化的差异基因,其中包括编码组氨酸激酶的调控基因tcs H。通过PCR扩增了野生型MP688和诱变株S17-19的tcs H基因,测序结果证明重测序结果正确。tcs H与下游的应答调节蛋白基因tcs R构成双组分系统,敲除基因簇tcs HR或其中任一基因的缺陷株几乎不合成PQQ,通过荧光实时定量PCR分析,显示双基因敲除菌TC2的pqq A转录水平显著下调,同时TC2的转录组分析也证实了这一点,说明tcs HR构成的双组分系统通过调控pqq A和pqq BCDE的转录水平调控PQQ的生物合成。Tn5诱变是一种研究基因功能的常用技术,对高产菌J1-1进行Tn5转座诱变分析,从8000余株突变株中筛选得到3株PQQ合成缺陷株1-20、1-52和5-179,通过质粒拯救法鉴定Tn5插入位点,确定突变基因分别编码亮氨酸氨肽酶、分支酸盐裂合酶和NADH脱氢酶等催化代谢途径的酶类。对这3个基因进行了敲除、回补和过表达检验,确定3者均能明显影响PQQ的合成,但都不是调控基因。另外,对亮氨酸氨肽酶进行了功能研究,发现该酶有可能识别并切割PQQ合成前体“glu-X-X-leu-tyr”中的L-亮氨酸,这一发现可能为阐明PQQ合成途径提供有价值的线索。在以甲醇为惟一碳源的PQQ发酵培养基中,PQQ合成受到某种因素的调控导致PQQ合成水平下降,推测这种调控作用是发酵液中的某种信号分子引发产生。在转录组分析中发现,在快长低产条件下编码酰基高丝氨酸内酯（AHL）合酶的基因oas II转录水平上调5-6倍,怀疑这种信号分子可能是酰基高丝氨酸内酯类化合物。用乙酸乙酯萃取培养液上清,考察了脂溶性提取物对J1-1菌体生长和PQQ合成的影响,发现该提取物能够刺激菌体快速生长,并引起PQQ合成水平下降。敲除oas II基因的缺陷株生长延迟期明显延长,PQQ产量略有降低,添加这种脂溶性提取物可使缺陷株恢复正常生长并阻遏PQQ合成。考察了脂溶性提取物对上述双组分系统缺陷株TC2生长和PQQ合成的影响,发现脂溶性提取物仍能够刺激菌体快速生长,提示AHL并不是通过调控tcs HR基因阻遏PQQ合成。对脂溶性提取物进行了LC-MS/MS分析,在野生菌及oas II敲除菌中发现了3-oxo-C10-HSL的存在,还发现3-oxo-C10-HSL标准品能够在一定程度上促进菌体的生长。根据上述实验结果推测,食甲基菌MP688 PQQ生物合成受某种群体感应调控系统控制,其调控信号分子为酰基高丝氨酸内酯类化合物。综合本文及本实验室其他研究结果,我们认为PQQ合成基因调控至少存在3种机制,一是tcs HR基因组成的双组分系统,其调控条件尚不明确,但在甲醇或果糖为碳源的培养基中都能够使PQQ合成基因高水平转录;二是某一未知系统,在甲醇或其代谢物的调控下控制某些PQQ合成必需基因的转录。虽然这两种机制尚不清楚,但可能不是导致PQQ发酵过程中菌体快速生长、PQQ合成阻遏的主要因素。第三种是以AHL为信号分子的群体感应调控系统,这个调控基因尚不清楚,它调控的靶基因包括重要的PQQ合成基因pqq A和pqq BCDE,是导致PQQ合成阻遏的主要机制。