牡蛎原肌球蛋白的分离纯化及酶解法对其抗原性的影响

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牡蛎(Ostreae)原肌球蛋白是一类普遍致敏的大蛋白分子,能刺激机体浆细胞产生大量特异性IgE,当其再次进入体内后与IgE抗体以线性抗原表位形式结合,引起组胺释放而致敏。因此,致敏性已成为以牡蛎为原料保健品及生物制品开发应用中潜在安全问题。本文以太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)软体部位为原材料,通过硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶G-75分离纯化含有特征分子量牡蛎原肌球蛋白,采用SDS-PAGE分析,研究木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和动物蛋白酶酶解牡蛎原肌球蛋白水解度及抗原性变化,主要研究结果如下:  1、硫酸铵沉淀得到分子量约为105 kD、30-45 kD、20 kD以下的蛋白组分,G-75层析柱分离得到两个洗脱峰,分别含有分子量约40 kD与98 kD组分;高效液相色谱分析显示两组分主要由三个成分组成。  2、比较三种蛋白酶对分子量约为40kD与98KD牡蛎原肌球蛋白蛋白水解度,研究发现木瓜蛋白酶水解度最大,约31.87±0.309%。其次是动物蛋白酶,约24.13±0.153%。中性蛋白酶水解度最低,约12.43±0.115%。  3、将40 kD及以上分子量牡蛎原肌球蛋白酶解产物进行SDS-PAGE电泳,研究发现木瓜蛋白酶2h内即酶解为17kD以下肽成分;动物蛋白酶对酶解效果和程度不如木瓜蛋白酶,而中性蛋白酶不能降解40 kD牡蛎原肌球蛋白。  4、采用ELISA法,将酶解产物与牡蛎原肌球蛋白进行竞争性结合多克隆血清抗体测试,研究发现木瓜蛋白酶酶解产物与血清抗体的竞争性结合能力最差,动物蛋白酶酶解产物次之,中性蛋白酶酶解产物最强,说明木瓜蛋白酶对牡蛎原肌球蛋白脱敏效果最好。  5、运用生物信息学方法,同源模建同类原肌球蛋白,并用NAMD2.7版本对其中蛋白肽进行动力学模拟及能量优化,分析推测该类原肌球蛋白刚性较大,构象不易发生变化,蛋白结构比较稳定、保守。  6、探索建立经口致敏小鼠模型,通过间隔口服给样,眼眶取血检测并结合小鼠激发状态行为特征和组织病理切片,实验发现牡蛎原肌球蛋白使小鼠血清组胺水平升高、小肠绒毛塌陷、支气管及管腔出现粘液,进而引发过敏反应。
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