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目的:探讨精原干细胞体外分离和非分化扩增的影响因素,为研究精原干细胞体内外生存条件及长期培养、定向分化和转基因奠定实验基础。方法:本研究中的实验动物选用2-5月龄绵羊公羔,取其睾丸以2步酶消化法、Percoll不连续密度梯度离心法、差速贴壁法分离纯化绵羊精原干细胞,分别以添加0%、2.5%、5%、10%胎牛血清的DMEM/F12或DMEM为基本培养液,以2×105细胞/cm2的密度接种于睾丸支持细胞或绵羊胎儿成纤维细胞饲养层上,分别置于33℃、35℃、37℃,饱和湿度,5%CO2浓度条件下培养,每星期换液2次。每间隔一定时间,置倒置显微镜下观察,或进行碱性磷酸酶(AP)组化染色检测、鉴定精原细胞。结果:1、Percoll不连续密度梯度离心和差速贴壁等方法可以有效的分离纯化绵羊精原细胞,其中精原细胞主要分布于密度梯度为27%～35%(密度1.0410g/ml～1.0508g/ml)的带间,纯度可达56.7%。2、37℃条件下培养SSCs不但能有效减少培养体系中的已分化精原细胞,还能促进干细胞的增殖。而在实验中,35℃条件下的细胞存活时间较长,增殖数量较多,35℃、37℃都是体外培养绵羊精原干细胞的较理想温度。3、在无血清培养液中培养一个星期,只有20%的细胞存活,然而在添加2.5%的FCS中,有大约80%的细胞存活并增殖,当血清浓度超过2.5%时,精原干细胞的比率下降,高浓度的FCS只是提高单个细胞的数目。4、在DMEM和DMEM/F12培养基中的细胞活力和增殖能力无明显差别。5、两种饲养层上的精原干细胞早期(1周内)的生物学行为非常相似,但培养1周后,Sertoli细胞作饲养层的培养体系中保留的精原干细胞要比SFFCs明显增多,约有30%的SSCs能存活下来并能维持存活到60d左右。Sertoli细胞作为绵羊精原干细胞体外培养的饲养层不但能促进其存活增殖,还是一种简单快捷的培养方法。结论:1、Percoll不连续密度梯度离心和差速贴壁等方法可以有效的对绵羊精原细胞进行分离纯化,两种方法结合分离和纯化效果明显提高。2.35℃、37℃都可以作为体外培养绵羊精原干细胞的温度。3.DMEM和DMEM/F12都适合做绵羊精原干细胞的基础培养基。在培养液中添加2.5%的胎牛血清可促进绵羊精原干细胞的增殖,为绵羊精原干细胞体外培养最适血清浓度。4、在不添加外源生长因子的情况下,饲养层对绵羊精原干细胞的存活、增殖是必须的,Sertoli细胞作为绵羊精原干细胞体外培养的饲养层可以促进其存活增殖,还简单快捷。