肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)是微小RNA病毒科,肠道病毒属的重要成员之一,其基因组由单股正链RNA构成。人类感染EV71临床上可表现为:疱疹性咽峡炎,无菌性脑膜炎,脑炎,肺水肿和手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)。其中感染EV71病毒的婴幼儿临床上可见严重的神经系统并发症,且可导致快速恶化甚至死亡。自从1969年报告了第一例手足口病症之后,手足口病在亚太地区形成了大流行,其中东南亚地区疫情尤其严重。1999年-2009年间,在中国人口密集的北京、深圳及广州,有50多万儿童受到由EV71引起的手足口病暴发疫情影响,最后导致了200个死亡病例。在人类成功战胜脊髓灰质炎病毒之后,EV71已被认作最重要的嗜神经性肠道病毒。目前,灭活疫苗是EV71疫苗发展的主要类型,3家国内企业自主研制的EV71灭活疫苗已经通过临床III期试验,正处于审批阶段。然而,灭活疫苗仍存在一些值得关注的问题。EV71诱导机体产生免疫保护具有复杂的机制,体液免疫和细胞免疫对于产生有效的保护效力而言均是十分重要的。由于灭活疫苗主要诱导的是体液免疫,不能充分诱导细胞免疫,因而不是最佳的EV71疫苗类型。减毒活疫苗是另外一种成功的疫苗类型,具有成本低,可诱导全面、长效的免疫反应等优点,世界上已成功开发了脊髓灰质炎、乙型脑炎和麻疹等疾病的减毒活疫苗,这为EV71减毒活疫苗的研制提供了参考。然而,传统的减毒活疫苗方法,主要通过体外体内传代方法获得,耗时较长且具有一定的不可控性。随着基因工程技术的发展,通过反向遗传学手段直接对病毒基因组进行操作以获得减毒株已成为可能,先后有多种基因工程减毒活疫苗问世。micro RNA是一类非编码的小RNA分子,广泛的表达于真核生物中。mi RNA可通过特异性识别并结合信使RNA(m RNA),进而达到抑制转录后的基因表达。由于mi RNA具有在组织、种属中均具备特异的表达谱且保持着高度保守的特性,近年来先后有学者将具有不同组织特异性的mi RNA靶序列插入不同病毒基因组内,使得病毒可在特定组织内复制而在关键组织中复制收到抑制的目的。这在保留病毒免疫原性的同时,又可降低病毒致病性,这一策略为研制新型减毒活疫苗提供了全新的角度。EV71感染主要导致神经系统损害,研究显示脑组织水肿,脑干及脊髓炎症在感染EV71死亡病例中最为严重,因此,如果能够抑制EV71在神经系统内的复制,则有可能大大降低EV71感染导致重症甚至死亡病例的风险。本研究中,我们首先通过反向遗传学操作构建EV71病毒的感染性c DNA克隆,能够高效地在细胞中拯救获得与亲本株生物学特性类似的恢复病毒;在此基础上,为了抑制EV71病毒在神经组织中的复制,我们选取在脑组织中丰度最高主要位于神经元细胞的mi R-124,及在神经元、星状细胞、神经胶质细胞内丰度较高的mi R-125这两种脑组织特异性micro RNA,将其靶序列插入EV71基因组5′非编码区不同位点,构建并拯救携带多个mi RNA靶序列的EV71重组病毒,鉴定了重组病毒的减毒特征;最后,我们在小鼠模型上评价了该重组病毒的免疫原性和保护效果,为下一步EV71减毒活疫苗的的研制提供参考。一、EV71病毒全长感染性克隆的构建与鉴定为了获得可稳定转染表达的EV71病毒全长感染性克隆,我们首先通过PCR扩增获得EV71病毒的全长c DNA并连接入p EV质粒,经体外转录后转染RD细胞,用RT-PCR、间接免疫荧光法和序列测定对恢复病毒进行生物学特征鉴定。上述结果表明,恢复病毒可在细胞内正确完成病毒RNA的复制及病毒蛋白的翻译表达,并形成与野生型病毒大小一致的空斑形态。乳鼠动物模型实验结果显示,恢复病毒感染乳鼠可引起与野生型病毒相似的神经症状和致死率。上述结果表明我们成功构建了EV71病毒全长感染性克隆,为下一步EV71病毒致病和减毒机理及新型减毒活疫苗的研究奠定基础。二、携带脑组织特异micro RNA靶序列的重组EV71病毒的设计与构建为了构建EV71减毒株,基于micro RNA的减毒机制,我们将脑组织特异的mi R124和mi R125靶序列,插入到EV71病毒基因组的5′非编码区内。通过对重组病毒的拯救与传代培养,我们获得了携带脑组织特异性mi RNA靶序列的EV71重组病毒。体外功能分析发现,该病毒具有与亲本株相一致的病毒感染、复制及蛋白表达能力。一步生长曲线表明,重组病毒在RD和Vero细胞上能够有效复制,而在神经细胞SK-N-SH上复制能力明显减弱。随后,我们进一步对实验结果进行验证,在转染入mi RNA mimic的Vero细胞上,重组病毒的复制能力及病毒蛋白表达均明显减弱,这说明重组病毒表现出的减毒特征与mi RNA调控机制有关。同时,该病毒在Vero细胞上能稳定遗传,连续8次传代,其基因组内插入的mi RNA靶序列未发生任何突变或缺失。最后,我们进一步研究了该病毒在乳鼠模型上的神经毒力及神经侵袭力。结果显示,EV71重组病毒以致死剂量颅内接种乳鼠,乳鼠全部存活,而亲本病毒组乳鼠全部死亡。以腹腔途径注射乳鼠,实时荧光定量PCR法未能在乳鼠颅内检测到病毒RNA,表明重组病毒神经侵袭力明显减弱。综上我们构建的重组病毒具有明显的减毒特征,这为我们下一步评价其免疫原性奠定了基础。三、EV71重组病毒的免疫原性及免疫保护分析最后,我们在小鼠模型上评价了携带脑组织特异性mi RNA靶序列的EV71重组病毒的免疫原性。结果显示,该重组病毒能够诱导产生与亲本株相似的体液免疫应答,其中和效价达到1:90。更为重要的是,该重组病毒免疫血清能100%保护乳鼠免受致死剂量的EV71病毒攻击。上述结果表明,该重组病毒具有良好的免疫原性,能产生较强的免疫保护作用。综上,本研究利用反向遗传学技术成功构建了携带脑组织特异性mi RNA靶序列的EV71重组病毒,该病毒在乳鼠动物模型上具有明显的减毒特征且能在细胞上稳定遗传。同时,该病毒具有良好的免疫原性,可同时诱导小鼠产生较高的体液免疫,其免疫血清可保护乳鼠免受致死剂量的EV71病毒攻击。上述研究结果,为今后研制EV71新型减毒活疫苗提供了全新的角度和理论支持。