鹿血是鹿科动物马鹿(Cervus elaphus)或梅花鹿(Cervus nippon)的血液,是传统名贵中药材,具有养血益精、行血祛淤、消肿的作用。鹿血在我国作为药用已有一千多年的历史,随着人们对健康需求的不断增强,鹿血的药用和保健作用的价值日益被国内外关注,市场上鹿血产品不断丰富,包括鹿血酒、鹿血粉、鹿血片等,市场价值和需求巨大。在经济利益驱使下,市场上时常出现两类伪品鹿血,一类是利用其它常见动物(猪、牛、羊、鸭等)血液冒充的伪品鹿血,另一类是在鹿血中掺入其他常见动物血液以次充好的掺伪产品。由于这些常见动物血液与鹿血在外观及理化性质上具有高度相似性,性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等传统中药鉴定方法在鹿血的鉴定中具有较大的局限性。因此,为寻找一种鹿血快速、准确的生物学鉴定方法,开展本课题的研究。目的:1.建立鹿血PCR-RFLP(聚合酶链式反应--限制性片段长度多态性)种间及不同基原鉴定方法。2.寻找鹿血与非鹿血鉴别的限制性内切酶,并确定鹿血中掺入其他常见动物血的检出限度。3.寻找鉴别梅花鹿与马鹿血的限制性内切酶,并确定梅花鹿血中加入马鹿血的检出限度。方法:1.用三种不同的试剂盒提取样品血液基因组DNA,测定浓度及纯度,选择适合提取本研究中动物血液基因组DNA的试剂盒。2.用动物DNA条形码通用引物COI和cytb(细胞色素b),扩增样品血液基因组DNA,以扩增效率高、扩增结果稳定为指标选取引物,并优化扩增条件。3.试剂盒法纯化PCR产物,T-A克隆(蓝白斑筛选及琼脂糖凝胶电泳确定阳性克隆),菌液进行基因序列测定。4.采用软件NEB Cutter2.0(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)对各样品血液的测序结果进行比对分析,确定试验中所购样品均为正品。根据各样品血液的cytb基因序列的差异,设计、选取可以区分鹿与非鹿、梅花鹿与马鹿的DNA限制性内切酶,并经实验验证。5.将提取的各样品血液基因组DNA稀释至相似浓度,且A260在0.1~1.0范围内。在梅花鹿血基因组DNA中分别加入不同体积分数的非鹿类动物血基因组DNA,在梅花鹿血基因组DNA中加入不同体积分数的马鹿血基因组DNA,经PCR扩增后,产物用限制性内切酶进行切割,确定检出限度。结果:1.试剂盒Blood&Cell Culture DNA Mini Kit(25)(QIAGEN,13323)的提取率较好,纯度较高。经电泳检测,该试剂盒提取的基因组DNA完整性较好,PCR扩增效率较高。2.通用引物cytb的扩增产物条带单一,COI对猪的扩增特异性差,有一条杂带。3.TA克隆菌液测定序列得到各动物cytb基因准确序列,片段大小分别为:梅花鹿472 bp、马鹿472 bp、猪463 bp、牛473 bp、羊473 bp、鸭473 bp。4.经软件NEB Cutter2.0分析,鹿区分非鹿的酶切位点为EcoRV,梅花鹿区分马鹿的酶切位点为MseI。EcoRV切割鹿的cytb基因通用序列,得到大小为287 bp、185 bp的两个片段,切割非鹿cytb基因通用序列,只得到一个大小为470 bp左右的片段;MseI切割梅花鹿cytb基因通用序列,得到大小为281 bp、191 bp的两个片段,切割马鹿cytb基因通用序列,得到大小为281 bp、126 bp、65 bp的三个片段,191 bp的片段作为梅花鹿血的特征片段,126 bp的片段作为马鹿血的特征片段。5.梅花鹿血中加入非鹿类动物血基因组DNA的检出限为3%,加入马鹿血基因组DNA的检出限为6%。结论:1.本研究建立的PCR-RFLP方法可以快速、准确地鉴定鹿血及相关伪品或掺伪品,也可以用于区分梅花鹿源或马鹿源的鹿血。2.本项研究为鹿血相关产品的质量控制提供了新的技术方法。