豚鼠妊娠母体和胎儿卵巢发育及PCNA和Caspase-3表达特性研究

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豚鼠是进行人类和家畜生殖生物学研究的良好实验动物模型,但是有关妊娠期豚鼠卵巢发育以及胎儿卵巢发生发育的组织形态学及其相关机制的报道很少。本研究采用人工授精技术获得妊娠母鼠,进而在妊娠期不同时间点(30、40、50、60、68天和出生后1天)采用组织学、免疫组织化学和免疫印迹分析等手段深入分析妊娠母鼠和胎儿豚鼠卵巢发育的形态学变化以及细胞增殖和细胞凋亡标记物的定位和相关蛋白信号的变化,力图阐明妊娠母鼠和胎儿豚鼠卵巢发育的规律和这一过程中细胞增殖和细胞凋亡相关蛋白信号作用机制,为人类和家畜繁殖学提供理论基础。  1.在本研究中,通过观察胎儿期30、40、50、60、68天和出生后1天的豚鼠卵巢细胞形态学变化,发现从妊娠期30天到出生后1天卵巢中的卵泡发育存在动态变化。研究结果还显示,妊娠期40~50天是豚鼠胎儿卵巢卵泡发育的关键时期。此外,当采用细胞增殖的标记——增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞凋亡的标记-caspase-3进行免疫组织化学染色,发现PCNA主要是在健康卵泡中表达,而caspase-3则主要在闭锁卵泡中表达。结果表明:豚鼠的卵泡发生和发育发生在胎儿时期,这不同于常用的实验动物大鼠和小鼠,因此,豚鼠可以为研究人类和家畜进行胎儿和新生儿卵巢的卵泡形成,发育和闭锁提供一个很好的动物模型。  2.在胎儿期豚鼠卵巢发育过程中,伴随着颗粒细胞的增殖,原始卵泡大量出现,同时,大多数卵母细胞会不断出现死亡,卵泡不断闭锁,这是细胞内凋亡因素与抗凋亡因素共同作用的结果,因此需要深入分析其精确机制。我们采用免疫印迹(WB)和灰度分析对胎儿期豚鼠不同时间点(胎儿期30、40、50、60、68天和出生后1天)细胞增殖与细胞凋亡因素的变化进行分析,结果发现,在胎儿期30、40、50、60、68和出生后1天等不同时间点,p-Erk1/2与细胞周期蛋白CyclinD的表达逐渐升高在妊娠期60天时达到最高,然后开始下降(Pb,Pc<0.05,Pd,Pe<0.01);而进一步对细胞凋亡因素分析,凋亡相关蛋白Caspase-3与Bax的表达在妊娠期50天逐渐升高,妊娠期68天和出生后1天持续高表达(Pb,Pc<0.05)。因此,在胎儿期豚鼠卵巢发育过程中,细胞增殖与细胞凋亡的共同作用调控了卵巢的发育。  3.妊娠期是从受精开始到分娩为止的一段时间,是新生生命在母体内生活的时期,在这一时期,卵巢并未呈现静止状态而是保持着与发情周期不同的卵泡发育。本研究采用组织学和免疫组织化学方法观察妊娠期豚鼠卵巢其细胞增殖与凋亡。结果显示:在胎儿期不同时间点(30、40、50、60、68天和出生后1天)母鼠卵巢的卵泡发育并未停止,除了在卵巢上观察到发育的黄体外,在卵巢上均有各级卵泡,而且,在卵巢上还存在大量的闭锁卵泡。细胞增殖标记物PCNA以及细胞凋亡标志物caspase-3主要定位于各级卵泡诸如初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡早期的颗粒细胞、膜细胞中,但未发现在卵母细胞中定位,此外,在卵巢间质细胞中PCNA和caspase-3表达显著。但是caspase-3定位于少量黄体细胞中。本研究证实在妊娠期母鼠卵巢出现的卵泡发育与闭锁与细胞的凋亡、增殖密切相关。  4.为了研究PCNA、caspase-3蛋白在豚鼠老年卵巢卵泡发育过程中的作用,取60月龄老年豚鼠的卵巢组织样,采用免疫组织化学方法对其在豚鼠卵巢中的表达进行了细胞定位,结果表明:在老年豚鼠卵巢中,caspase-3主要在卵母细胞、颗粒细胞、膜细胞以及间质细胞中表达,不过相对于颗粒细胞,间质细胞中caspase-3的表达较多,此外,黄体细胞中caspase-3也有表达;PCNA在卵母细胞、颗粒细胞、膜细胞以及间质细胞中表达,在老年豚鼠卵巢的黄体中也检测到了PCNA的表达,与caspase-3不同的是,PCNA在颗粒细胞中的表达比其他细胞表达都要多。PCNA与caspase-3在老年豚鼠卵巢中的呈现细胞和空间特异性表达差异表明,这两种蛋白可能参与老年豚鼠卵泡生长发育、衰老和黄体形成过程。
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