随着抗生素的不合理和大规模使用,细菌的耐药性越来越强,这让细菌疾病的治疗再一次陷入困难,寻找新型的抑菌药物已成为非常重要的研究课题。天然产物的开发与利用是目前的研究热点,川白芷Angelica dahurica(Fish.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan是著名的川产道地药材之一,以根入药,具有良好的药效价值和多种药理活性。目前,川白芷的抑菌作用研究较浅,作用成分的代谢途径更是鲜见研究。本研究以课题组前期选育的川白芷新品种为材料,通过对其提取物进行体外抑菌、群体感应抑制和中药-抗生素联用等试验,以期阐明川白芷的抑菌作用及机理,为寻找新型的抑菌药物提供理论依据;通过对川白芷转录组数据的挖掘,寻找调控川白芷中抑菌物质的代谢途径关键酶基因,为川白芷抑菌成分的进一步开发利用,遗传育种和代谢工程奠定基础和提供科学依据。主要研究结果如下:(1)以川白芷根部为材料,通过醇提法得到川白芷粗提药液,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌进行体外抑菌能力效果试验。结果表明,川白芷粗提物对四种致病性菌株都有一定程度的抑制作用,其中粗提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果优于其余两种菌。利用连续倍比稀释法试验,得到川白芷提取液对四种细菌的MIC分别是:金黄色葡萄球菌=大肠杆菌=铜绿假单胞菌=250 mg/mL,肺炎克雷伯氏菌=500 mg/mL。对得到的粗提液进行有机溶剂萃取,得到石油醚相(PE)、三氯甲烷相(CE)、乙酸乙酯相(EE)、正丁醇相(NE)和萃余相(RE),结果表明,四种供试细菌的生长都受到萃取相的抑制。其中EE的抑菌谱最广,抑菌活性也最强,对4种供试菌都表现出抑菌活性。结合抑菌谱和抑菌活性综合分析,各萃取相的抑菌强弱依次是EE、NE、CE、PE、RE。利用连续倍比稀释法试验,结果表明,对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的是EE相,MIC为1.56 mg/mL;对大肠杆菌抑菌效果最好的是EE,CE,NE相,MIC为1.56 mg/mL;对肺炎克雷伯氏菌抑菌效果最好的是EE和NE,MIC为75 mg/mL;对铜绿假单胞菌抑菌效果最好的是EE和NE,MIC为100 mg/mL。对萃取相进行成分定性分析,发现川白芷中明显含有内酯/香豆素类、黄酮类、酚类成分,其中香豆素类成分主要集中在乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相中,表明川白芷中抑菌作用最好的成分为香豆素类成分。(2)以群体感应研究的模式菌株——铜绿假单胞菌为试验对象,考察川白芷提取物对其毒力因子绿脓菌素、胞外蛋白酶、生物膜形成、泳动性的影响。结果表明当提取物浓度在25 mg/mL时,能对铜绿假单胞菌的四种毒力表型起到明显的抑制作用,证明川白芷可以抑制细菌群体感应;而在提取物浓度低于25 mg/mL时,川白芷有促进群体感应的作用。不同萃取相提取物的化学成分定性分析结果表明,白芷提取物中起到抑菌作用的活性成分主要是极性较大的香豆素、黄酮苷元及黄酮苷。(3)细菌耐药性的生成,主要原因是因为细菌会形成生物膜,这层膜能够很好地阻隔抗生素对细菌的破坏。我们通过筛选产膜能力较好的耐药性金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行抑菌试验,结果表明,川白芷中的香豆素类物质能够很好地抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的产生,也能够破坏成熟的生物膜;当香豆素类物质和抗生素联用时能够起到积极的协同作用,得到了联用效果较好的配比方案,在抑菌过程中,既降低了抗生素的使用,又能减少耐药性菌株的产生。总体上来看,就金黄色葡萄球菌来说,简单香豆素联合对其生物膜抑制活性较其他香豆素衍生物及发卡二醇活性较高;而花椒毒酚和氨苄西林联用对铜绿假单胞菌生物膜的抑制作用较好。(4)基于转录组测序获得的序列信息,从白芷中成功克隆到2个香豆素合成相关基因,并对其进行了生物信息学分析。结果显示,克隆的12956基因cDNA开放阅读框长度为1104 bp,编码367个氨基酸残基,蛋白的理论分子量(MW)为40.69 kDa,等电点(pI)为6.06;克隆的2646基因cDNA开放阅读框长度为1080 bp,编码359个氨基酸残,蛋白的理论分子量(MW)为39.33 kDa,等电点(pI)为5.82。所获得的两个基因,均属于亲水性蛋白,都是稳定的蛋白结构,可能并非分泌蛋白,基本处于膜外。空间结构预测该蛋白的二级结构主要含有α螺旋、延伸链、β折叠、无规则卷曲。结构分析表明,12956属于2-氧戊二酸(2OG)和Fe(II)依赖性加氧酶超家族,2646属于O-甲基转移酶家族。通过目前香豆素类成分生物合成代谢途径的研究,预测12956和2646两个酶都可能参与到香豆素类合成代谢,并处于苯丙烷代谢途径下游,12956是阿魏酰辅酶A生成6-羟基-阿魏酰辅酶A过程中的关键酶,2646是羟基佛手柑内酯生成佛手柑内酯过程中的关键酶,其具体功能有待进一步深入研究。