沙门氏菌(Salmonella)是一种重要的食源性致病菌,由其引发的食物中毒病例在世界范围内居首位。依据抗原结构的差异,可将该菌分为46个血清组,2600多个血清型,能够感染人类的致病菌株主要集中在A、B、C1、C2和D血清组中,其中,C1血清组包含多个高致病性的沙门氏菌血清型(如猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌和婴儿沙门氏菌等)。O7抗原是C1血清组所特有的抗原,但是,对其形成的遗传途径却知之甚少。本课题组前期依托沙门氏菌基因组学和生物信息学平台,采用比较基因组学的方法挖掘出沙门氏菌C1血清组的7个特异基因。这些C1血清组特异基因的编码产物全部为功能未知的蛋白,如:SC2092、SC0368和SC0595,这三个基因编码含有多个跨膜域的膜蛋白。对它们功能的分析将进一步揭示C1血清组特有O7抗原合成的遗传途径,并为阐明血清型与基因型的关系提供实验证据。本研究采用生物信息学方法分析并预测了沙门氏菌C1血清组特异基因与编码蛋白的一级结构序列、二级拓扑结构及其功能;采用同源重组的方法,构建了基因缺失突变株,通过评价突变株在血清凝集、生长状态、细胞结构、运动能力等多个方面的变化,得到了受到特异基因缺失影响的生物学通路;再利用RTqPCR和RNAseq技术,在转录水平上,探讨了受到C1血清组特异基因影响的关键基因与调控通路,并检测了差异基因的表达情况。综合上述结果,本研究得到沙门氏菌C1血清组特异基因的功能和/或对C1血清组菌株(以猪霍乱沙门氏菌为代表菌株)的生物学特征的影响。主要研究内容和结果如下:1)生物信息学方法预测基因功能从ncbi网站(http://ncbi.nlm.nih.gov/)上,分别下载了c1血清组特异基因sc2092、sc0368和sc0595的核苷酸与对应的氨基酸序列,使用blastn(p)软件对它们的一级结构序列进行同源比对,再使用topcons软件对三个膜蛋白进行拓扑二级结构预测。结果表明:a)这些基因的核苷酸及其对应氨基酸在沙门氏菌c1血清组中具有高度的序列保守性和特异性,仅在属于c1血清组的菌株中存在,而在其它的沙门氏菌血清组或其它非沙门氏菌菌株中不存在;b)特异基因sc2092,位于o抗原基因簇上,编码具有12个跨膜域的膜蛋白(o抗原翻转酶wzx的重要特征之一),与鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的wzx/wzx相比,虽然序列的同源性极低,仅分别为0.8%/23%和4%/24%,但拓扑结构却高度相似(o抗原翻转酶wzx的另一重要特征),体现在:在topcons软件的预测结果中,采用不同的算法预测三个wzx蛋白的n端和c端均在细胞质侧,而使用同一算法时,它们的跨膜域数目和间隔环有着几乎完全相同的结果;c)特异基因sc0368和sc0595,位于o抗原基因簇外,编码含10个跨膜域的膜蛋白,它们的序列具有高度的同源性,核苷酸的同源性为87%,氨基酸的同源性为83%,并且具有几乎完全一致的二级拓扑结构。2)同源重组质粒的构建与缺失突变株的筛选依据巢式pcr的原理设计特异引物,经过两轮pcr扩增获得同源臂片段;通过电转化的方法,在2500v,5ms的条件下,将同源臂片段连接于高效蔗糖自杀质粒pre112,成功获得同源重组质粒pre△wzxc1,pre△0368与pre△0595;采用两步同源重组法(共结合和蔗糖筛选),以野生型为亲本菌,获得无标记缺失突变株△wzxc1、△0368和△0595,以△0368突变株为亲本菌,获得无标记双突变株△0368△0595。突变株的获得为后期生物学特征的比较和高通量rna测序(rnaseq)提供了实验材料。3)c1血清组特异基因与表面抗原的相关性分析采用血清玻片凝集和脂多糖(lps)sds-page电泳检测相结合的方法,来分析缺失突变株菌体表面抗原的变化情况。结果显示:a)特异基因sc2092缺失突变株不能形成完整的lps(o抗原区域全部缺失),该突变株与o7抗血清的凝集反应表现为阴性,抗原的变化结果与生物信息学预测结果相符,因此,该基因在本课题中被命名为wzxc1;b)特异基因sc0368和sc0595的缺失突变株(△0368、△0595和△0368△0595)与o7抗血清的凝集反应均表现为阳性,并且,与野生型相比,在三个突变株的lps凝胶电泳图上未发现显著的可见差异,表明这两个基因的缺失都未导致o7抗原合成受阻,然而,基因sc0368的缺失(突变株△0368和△0368△0595)却影响了hc抗原的合成,即与hc抗血清的凝集反应表现为阴性。4)c1血清组特异基因缺失突变株的表型特征检测a)沙门氏菌c1血清组特异基因sc2092(wzxc1)的缺失,使细菌缺乏在固体培养基表面的蠕动能力和半固体琼脂中的游动能力,电子显微镜检测和rt-qpcr的分析结果表明,自凝聚能力的增强和鞭毛合成相关基因表达量的下降是导致运动缺陷的主要原因。另外,wzxc1突变株对nacl更加敏感,一旦在培养基中添加1%的nacl,突变株细胞即呈现自凝聚现象,但是在无nacl添加的培养基中,突变株△wzxc1的运动缺陷、自凝聚和鞭毛合成相关基因表达量下降现象都会得到恢复。因此,本研究提出了“wzxc1缺失引发nacl依赖型运动缺陷”的新理论;b)沙门氏菌c1血清组特异基因sc0368的缺失,导致细菌生长速度的提高,但是运动能力却丧失。在细菌生长的稳定期,突变株△0368和△0368△0595的生长量(ca.1010cfu/ml)比野生型和△0595(ca.108cfu/ml)的生长量高2个数量级;鞭毛银染、电镜检测和运动性(蠕动与游动)分析实验的结果均表明,在基因sc0368缺失突变株(△0368和△0368△0595)中,鞭毛不能合成,细菌不能运动;c)沙门氏菌C1血清组特异基因SC0595的缺失,未发现对细菌的生物学特征有明显影响。5)RNAseq与RT-qPCR方法分析差异表达基因为了更全面的了解C1血清组特异基因SC0368与SC0595对细菌的影响和两个基因之间的关系,本研究利用高通量的RNAseq技术分析了△0368、△0595与△0368△0595突变株与野生型菌株相比的表达差异基因,并采用RT-q PCR方法对关键基因进行了验证。结果表明:a)C1血清组特异基因SC0368和SC0595在LPS的合成过程中具有协同作用,只有它们同时缺失(△0368△0595 vs.野生型)才会导致与LPS核心合成相关的6个基因表达量的显著下调;b)在突变株△0368和△0368△0595中,与鞭毛合成以及与细菌趋化能力相关的两条通路中20个基因的表达出现大幅度下调,这些基因属于鞭毛合成级联效应的第三组(class 3),而fli A基因(编码σ28转录调控因子)是第三组的首要启动基因,它极有可能是首先受到SC0368基因影响的关键因子。综上所述,本研究从生物信息学预测,缺失突变株表型验证及其转录水平(RNAseq与RT-qPCR)对比分析三个角度,逐层探讨了沙门氏菌C1血清组特异基因SC2092、SC0368和SC0595的功能及其对C1血清组代表菌株(猪霍乱沙门氏菌)生物学特征的影响。本研究将沙门氏菌血清组特异基因与O抗原/LPS的合成建立了联系,为揭示血清型与基因型的关系提供了实验证据。特异基因缺失突变株的表型变化结果与转录水平的差异分析数据,丰富了细菌生长、运动、粘附等现象的分子调节机制。本研究中获得的实验结果为更好地了解沙门氏菌C1血清组特征,特别是其共有抗原的形成过程具有重要意义。