第一部分：帕金森氏病相关蛋白α-synuclein的表达纯化及生物学功能的初步研究 α-synuclein蛋白（SNCP）广泛存在于大脑内，是一种脂结合的突触前蛋白。最近发现α-synuclein基因（SNCA）的突变与家族性帕金森病（Parkinson’s disease，PD）相关，提示它可能为此类疾病发生的分子桥梁而成为研究的热点。因此，进一步研究该蛋白的结构和功能对理解SNCP在神经系统疾病中的作用有着重要的意义。14-3—3蛋白是高度保守的、所有真核生物细胞中都普遍存在的一类蛋白调控家族，它在细胞的信号转导中起着至关重要的作用。由于14-3-3蛋白也与PD密切相关，SNCP与14-3-3蛋白的在结构和功能上存在着高度的一致性，探讨SNCP与14-3-3蛋白可能的分子间作用对进一步了解PD以及相关的神经退行性疾病的致病机理有着重要意义。 本研究从人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术扩增获得SNCA，测序正确后亚克隆至原核表达载体pQE-30-GST，在大肠杆菌中表达GST-SNCP融合蛋白，融合蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行纯化。用纯化的SNCP蛋白免疫新西兰大白兔，制备了SNCP多克隆抗体，抗血清的ELISA效价达到1:32000。产生的抗体具有良好的免疫反应性，能够识别基因工程表达的SNCP，并且也能识别动物脑组织中天然的SNCP。 通过免疫共沉淀、GST pull down和ELISA等技术证明SNCP能够在体外与14-3-3蛋白发生分子间相互作用；为了进一步证明SNCP也与在脑组织中天然的14-3-3蛋白发生作用，本研究利用GST pull down以及His pull down方法进行实验，结果证明SNCP能够和脑组织中的14-3-3蛋白发生相互作用。这些结果从分子水平提供了SNCP与14-3-3蛋白相互作用的实验证据，为进一步了解SCNP的结构和功能及其在中枢神经系统退行性疾病的作用提供了必要的实验基础。 第二部分：PrP特异性基因工程Fab抗体和IgG全抗体的制备 可传播性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathies，TSE）是一类累及多种动物和人类中枢神经系统的致死性退行性疾病，潜伏期长，100％死亡。在人类主要表现为克一雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD），包括有散发性、家族遗传性和获得性。共同的病理改变为中枢神经系统神经元退行性变性、脑实质中淀粉样变性形成斑块和空洞、呈海绵状，胶质细胞增生，并且存在正常朊蛋白的异构体PrP。目前认为是由一种新型的由蛋白质组成而缺乏核酸的感染因子-PrP引起，其前体为存在于神经元细胞的正常膜蛋白PrP。对于该病目前还没有特异性的诊断和治疗方法，抗体在Prion的研究中起着极为重要的作用。 本研究利用噬菌体抗体库技术，以获得鼠源抗PrP抗体，并进行了全基因的表达。首先用纯化的HaPrP23-231，GST-HuPrP23-65，HuPrP23-231，以及HuPrPl06-126（人工合成）免疫BALB／c小鼠，由于HuPrPl06-126分子量小于2000 Dalton，属于半抗原，采用化学偶联法将短肽与血蓝蛋白（KLH）偶联。每种蛋白免疫5只BALB／c小鼠，共免疫4次，每只小鼠腹部皮下多点注射100μg抗原（溶于200μ生理盐水中）。免疫3次取尾血检测抗体效价，发现用HaPrP23-231免疫的小鼠可产生较高效价的抗体，可以用于下一步实验。 取脾后提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以其为模板进行免疫球蛋白Fab区基因的特异性PCR扩增，将轻链和重链Fd段基因分别构建到pCom3质粒中，电转化XL1-Blue菌，构建噬菌体抗体库。通过对轻重链插入率的鉴定，和噬菌体浓度的滴定确定库中的有效克隆数约为10<5>-10<6>。 用纯化的HaPrP23-231作为固相抗原对原始抗体库进行筛选，经过四轮“吸附-洗脱-富集”的过程后获得了12株阳性克隆。我们将获得的克隆在大肠杆菌中对它们进行了可溶性表达。我们挑取5株进行序列分析，并将结果与GenBank中已知序列库中的IgG序列进行比较，证明它们是新的抗体序列，得到了两株不同的抗体，分别命名为IV-66和IV-78。我们用亲和层析法对Fab抗体进行了纯化，通过免疫印迹实验发现纯化后的抗体免疫反应性及特异性都得到了提高。免疫印迹分析时发现，两株单抗都能与重组的PrP蛋白反应，而且可以和真核表达的PrP以及天然状态的PrP反应。 为了获得抗HaPrP23-231的全抗体，本研究将上述获得的IV-78 Fab抗体的重链Fd段和轻链基因分别克隆入杆状病毒表达载体pAC-K-Fc中，转染sf-9昆虫细胞。通过空斑纯化，获得表达抗体基因的重组杆状病毒，感染昆虫细胞进行抗体的全基因表达，当观察到细胞形态变大、稍有脱落现象出现时收集培养上清留做毒种，而细胞做免疫荧光检测，镜下观察有绿色荧光的阳性细胞。表达产物经Protein-G亲和柱纯化获得的IgG抗体。SDS-PAGE电泳和免疫印迹实验证实了IV-78的表达情况。紫外分光光度法检测纯化抗体浓度为7.2mg/L。ELISA鉴定将该纯化抗体稀释十万倍时仍可检出。免疫印记和免疫共沉淀实验等方法证明了IV-78全抗体不仅可以和原核表达的PrP23-231反应，而且可以和真核表达的野生型全长huPrP反应，同时能够识别羊瘙痒因子实验动物脑组织中的PrP。 本研究获得了两株鼠源抗PrP的Fab抗体，并构建获得一株IgG全抗体，为朊病毒病的研究、诊断检测方法的建立、甚至可能为治疗性研究提供了物质基础。