工业酶在催化反应过程中结构变化规律的研究是生物催化机制研究的难点和重要内容。真菌脂肪酶,例如根霉脂肪酶,作为脂肪酶家族的一个重要分支,结构复杂且功能多样,使得其工业应用广泛,但是前导肽结构信息和盖子动态信息等催化机制研究的不完善导致对其改造往往效率较低。X射线衍射技术可以解析蛋白质三维晶体结构,但是无法提供蛋白质动态变化信息,而核磁共振技术在研究蛋白质溶液中动态变化方面具有明显优势,但是由于分子量大导致图谱分辨率下降等原因使得大分子量蛋白质(>20kDa)尤其是真菌来源蛋白质的同位素标记及化学位移归属一直是制约核磁共振技术应用的瓶颈。晶体结构可以为大分子量蛋白质的化学位移归属提供空间结构信息,因此结合X射线衍射及核磁共振技术研究脂肪酶的结构及催化动力学可以为理性改造提供指导,对拓展脂肪酶工业应用具有重要的实践价值和理论意义。本研究以分子量为33 kDa的华根霉脂肪酶(RCL)为研究对象,解析其晶体结构,在大肠杆菌中高效表达同位素标记RCL,借助晶体结构辅助完成化学位移归属;利用核磁共振技术获得RCL在溶液状态下的构象及动态信息,通过对前导肽结构的分析解析了其对RCL性质影响的机理,揭示了有机溶剂对RCL催化活力影响的机理;并通过对加入前体后毕赤酵母代谢通量的分析考察了其无法利用前体表达ILV标记氨基酸的机理。(1)为了填补根霉脂肪酶前导肽结构的空白并为核磁共振研究提供结构基础,通过晶体生长条件优化,获得大小为0.06×0.05×1.5 mm,长棒状RCL晶体,通过X射线衍射晶体数据收集、处理与优化,母体晶体绕射最高分辨率为2.0 A,以雪白根霉脂肪酶晶体结构为同源模型分子置换解析了带有前导肽结构的RCL晶体结构,PDB登录号为4L3W。RCL晶体结构为单体,为典型的脂肪酶家族α/β结构,由S172-H284-D231构成催化三联体,T110及L173组成了参与底物稳定的“氧洞”,G109-T123为覆盖在催化中心上方的α螺旋及两段loop的“盖子结构”。RCL中7个半胱氨酸形成了三对二硫键,T24-G31位氨基酸残基电子云密度缺失,D1-S23号氨基酸柔性较大。(2)生物学研究中很多重要蛋白为真核来源,毕赤酵母作为真核表达系统对外源蛋白尤其是真核蛋白的表达优势明显,但是目前同位素标记蛋白在毕赤酵母中表达效率低且无法进行2H,13C,15N;1H-Ile δ1,Leu-δ,Val-γ(ILV)标记来提高大分子量蛋白质的图谱质量,极大地限制了其在大分子量蛋白同位素标记中的应用。为了解决真核来源蛋白在毕赤酵母中同位素标记的困难并为RCL核磁共振研究提供基础,通过条件优化,表达了 13C,15N-双标记RCL,表达量为26 ± 3 mg·L-1,标记效率为84 ± 3%。表达2H-标记RCL,表达量为4.5 mg·L-1,2H-标记率为59%。为了探索在毕赤酵母中进行ILV标记的可行性方案,研究了加入前体Val和α-KB及α-KIV对毕赤酵母分批培养过程中的中心碳代谢的影响,发现毕赤酵母的细胞膜上缺少对α-KIV的转运体,阻碍了其进入细胞质合成Val和Leu;α-KB可以进入Ile的合成路径,但是效率较低;而Val可以直接进入细胞质脱去酰胺基生成α-KIV进而被细胞质中的支链氨基酸氨基转移酶合成Leu。从而提出通过构建α-KIV转运体及α-KB转运体或苏氨酸脱氨酶缺陷型菌株的构建来实现毕赤酵母表达2H,13C,15N;1H-Ile δ1,Leu-δ,Val-γ标记蛋白。(3)目前真核来源的大分子量蛋白在大肠杆菌中的同位素标记尤其是ILV标记仍是核磁共振研究中的热点和难点。为了建立在大肠杆菌中高效表达真核蛋白尤其是含多个二硫键蛋白的方案,并对RCL进行ILV标记来完成化学位移归属,结合大肠杆菌BL21trxB(DE3)及MBP融合表达标签,表达了 13C,15N-双标记RCL,表达量为15 ±2.5 mg·L-1,效率为99 ±0.2%,形成与毕赤酵母表达相同的三对二硫键;表达了 2H,13C,15N;1H-Ile δ1,Leu-δ,Val-γ标记RCL,表达量为4.3 mg·L-1,借助晶体结构中氨基酸空间信息人工完成主链化学位移归属229个,ILV氨基酸侧链归属83个。经验验证结果表明化学位移归属符合经验法则,BMRB登录号为26923。(4)脂肪酶在溶液中的结构变化和动力学是催化反应的关键,为了研究前导肽对根霉脂肪酶性质影响机理及脂肪酶盖子在溶液中的动力学,通过15NNMR驰豫实验、欧沃豪斯效应图谱信号峰以及残留偶极耦合实验测定了 RCL在溶液中的结构及分子运动情况,结果表明:RCL前导肽电子云密度缺失部分对应无规则卷曲的结构,而前导肽T4-A21号氨基酸残基存在二级结构且与主体蛋白之间存在相互作用;前导肽“锚定”在活性中心上方,并且进一步说明RCL盖子在溶液中处于闭合状态;盖子区域中两侧的铰链区及位于盖子α螺旋外侧的氨基酸残基柔性较大,溶液中盖子在微秒级别存在开盖和闭盖构象之间的互换现象。前导肽27个氨基酸并没有增加RCL的表面疏水性,而是与盖子及主体蛋白之间形成盐桥、氢键及疏水相互作用力等,可能对活性中心的化学环境产生影响,稳定盖子结构,进而影响催化性质。进一步通过关键位点突变体的性质测定验证了其对RCL催化效率的影响包括:与盖子相互作用影响脂肪酶的界面激活以及与活性中心相互作用影响其化学环境。(5)目前有机溶剂对脂肪酶影响机理尚无定论,为了研究有机溶剂对脂肪酶的“激活”机理,测定加入有机溶剂脂肪酶动力学参数的变化,结果发现有机溶剂浓度低于20%时,RCL的KM值提高,而浓度提高至20%以上后,KM值增加明显,随着加入浓度的提高kcat值上升,在20%-30%时催化效率最高。通过比较加入不同有机溶剂RCL的二维图谱,发现加入20%有机溶剂蛋白整体结构保持稳定。绝大多数氨基酸峰高降低、动态增加,而甲醇、乙醇、异丙醇和DMSO的整体变化大于丙酮,与其催化效率高相对应。峰高变化明显的氨基酸残基主要是蛋白表面的疏水氨基酸,尤其是盖子铰链结构上的V121,说明盖子的动态变化最为显著,从而有利于催化反应的进行。加入五种极性有机溶剂不仅影响表面氨基酸的微环境,也可以“渗透”到蛋白内部。尤其是盖子铰链部位氨基酸G109、M120,前导肽靠近催化中心的G6、L12以及催化中心附近的G174在五种极性有机溶剂中化学位移都非常显著,说明加入极性有机溶剂不仅提高盖子动态,而且使盖子打开幅度增大,从而促进催化反应的进行,并且在浓度增大到一定程度后很可能在活性中心与底物发生竞争从而降低催化活性。