树突状细胞(Dendritic cell，DC)是机体免疫系统中迄今发现的功能最强大的抗原呈递细胞。其在摄取、处理抗原后，在迁移过程中成熟，从外周非淋巴组织通过淋巴管和（或）血循环进入次级淋巴器官，刺激初始T细胞和B细胞的活化和增殖，促进固有免疫和启动获得性免疫，同时也在维持机体的免疫耐受和调节免疫应答过程中起到关键性的作用。DC与肿瘤的产生、发展及预后有密切的关联，肿瘤组织周围及外周DC数量减少和功能缺陷可导致机体对肿瘤免疫无能或免疫耐受。利用DC抗肿瘤治疗，首先需要增加体内DC数量、增强DC定向迁移和抗原递呈能力，从而激发抗肿瘤免疫应答。因此，深入了解DC的体内迁移途径和分布特点对于进一步阐明DC和肿瘤免疫之间的关系显得尤为重要。　　第一部分、小鼠DC体外诱导扩增方法的建立及其特性检测　　目的：建立和优化获得大量DC的稳定培养方法，为研究其特性和功能提供大量的细胞来源。　　方法：采用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(10ng/ml)和重组小鼠白细胞介素4（1ng/ml）诱导小鼠骨髓单核细胞分化为未成熟DC。在第6日加入TNF-α(10ng/ml)刺激细胞成为成熟DC。利用倒置相差显微镜观察细胞形态，流式细胞术鉴定细胞表型CD11c、CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ、CCR7、吞噬能力、凋亡情况，酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清液中细胞因子IL-12p70、IFN-γ的含量，混合淋巴细胞反应检测诱导的DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力。　　结果：诱导细胞具有典型单核细胞形态，表面大量细小突起，呈毛刺状。80％以上诱导细胞表面表达CD11c。不成熟DC低表达CD40、CD80、CD86、MHC--Ⅱ、CCR7，具有较强的吞噬能力，较弱的T细胞激活能力，分泌较少的IL-12p70、IFN-γ，而成熟DC则与之相反。该种诱导方法未见细胞明显凋亡现象。　　结论：通过采用该种诱导方法，培养出大量具有典型的形态、表征和功能的骨髓源性DC。　　第二部分、磁性纳米粒子的合成及其标记DC的体外观察　　目的：合成超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米粒子并标记小鼠骨髓来源DC，评估纳米粒子对树突状细胞的影响，为进一步观察研究树突状细胞体内迁移和分布奠定基础。　　方法：共沉淀法制备γ-Fe2O3纳米粒子，将该粒子(25μg/ml)与按第一部分所述方法得到的小鼠骨髓来源DC孵育12小时，PBS洗涤后收获DC，普鲁氏蓝染色显示细胞内铁，收获纳米粒子标记培养第7天的成熟DC经透射电镜观察DC的超微结构，检测细胞内摄铁量，流式细胞仪检测表面标志、吞噬能力，Annexin/PI双染色法检测凋亡，酶联免疫吸附法检测标记细胞培养上清液中细胞因子IL-12p70、IFN-γ的含量，混合淋巴细胞反应检测标记DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力。　　结果：合成纳米粒子近似呈球形，表现良好的超顺磁性，表面带正电荷且平均电荷为20.9mv。经普鲁士蓝染色观察纳米粒子标记DC发现几乎所有的细胞都被染成蓝色，证实标记细胞内含有标记的铁离子。透射电镜观察可见标记细胞的胞体多呈圆形或椭圆形，表面形态不规则，细胞膜有伸展的突起，胞浆内含有深黑色球形团块。未成熟和成熟DC细胞内含铁量分别为31.8±0.7μg/1×106个细胞和35.6±1.0μg/1×106个细胞。与未标记细胞相比，标记后的成熟DC表面标志(CD80，CD86，MHC-Ⅱ，CCR7)、细胞因子的分泌(IL-12p70，IFN-γ)和凋亡均未见明显差异;纳米粒子标记细胞后对T细胞活化能力未见明显影响。　　结论：合成的氧化铁纳米粒子具有良好的超顺磁性，符合SPIO的特征。对DC，尤其是mDC的标记表现出优良的生物相容性，无明显细胞毒性，对细胞的表征、功能、凋亡均未产生明显影响。这为下一步研究树突状细胞体内迁移奠定了良好基础。　　第三部分、磁性纳米粒子标记EGFP-DC体内示踪观察　　目的：采用磁共振成像和光学成像技术，观察SPIO纳米粒子标记的小鼠骨髓来源DC在小鼠体内迁移状况，分析其移行途径和分布特点。　　方法：按第一部分所述方法获得EGFP转基因小鼠骨髓（遗传背景C57BL/6）来源DC，即EGFP-DC，激光共聚焦观察细胞形态和荧光表达。按第二部分所述方法获得SPIO纳米粒子，标记EGFP-DC，流式细胞仪检测该细胞荧光强度变化。磁共振检测其体外成像和注入小鼠(遗传背景C57BL/6)右侧足垫后引流淋巴结的成像状况，并用光学成像仪对离体引流淋巴结进行离体成像，组织学检查、验证，并测定迁移细胞比例。　　结果：激光共聚焦显微镜观察发现所有细胞均表达强烈的绿色荧光信号，氧化铁纳米粒子标记对EGFP-DC中荧光蛋白的表达未产生影响。磁共振成像发现1×104个细胞在体外具有良好的可探测性，体内成像可清晰显示小鼠双侧腹股沟、腘窝内清晰的淋巴结形态影像，右侧腘窝淋巴结内可见明显的信号减低区（黑色区域），而左侧对照腘窝和双侧腹股沟淋巴结内却未见信号减低;淋巴结离体光学成像同样右侧腘窝淋巴结表达强烈荧光，左侧对照腘窝和双侧腹股沟淋巴结未见明显荧光表达。EGFP免疫组化和普鲁士蓝染色显示，小鼠淋巴结的皮质区域含有散在的、明亮的EGFP阳性细胞和蓝色铁颗粒表达。经流式细胞仪检测小鼠右侧腘窝淋巴结内含有约4％EGFP阳性迁移进入的DC，而同侧腹股沟淋巴结内却未见标记细胞。　　结论：SPIO和EGFP均是良好的生物标记材料，通过磁共振和光学成像结合免疫组化可以清晰显示DC的体内迁移状况。　　第四部分、近红外染料标记DC在荷瘤鼠体内分布的观察　　目的：利用近红外染料标记DC，利用光学全身成像方法观察其静脉注射后在口腔癌荷瘤小鼠体内肿瘤组织，体表、腹腔淋巴结及主要器官的分布情况。　　方法：建立小鼠口腔癌移植瘤模型（遗传背景C3H/HeJ），按第一部分所述方法诱导扩增C3H/HeJ小鼠骨髓单核细胞形成DC。近红外染料Cy5.5体外标记DC，并对其进行功能、凋亡和荧光强度等检测。按照6、12、24、36、48小时不同时间点经小鼠尾静脉注入Cy5.5-DC，麻醉、脱毛后行活体光学成像，随即解剖移植瘤、脑、肺脏、心脏、胸腺、肝脏、脾脏、肾脏、双侧腹股沟、双侧腋窝和肠系膜淋巴结，分别进行离体成像。　　结果：激光共聚焦显示Cy5.5对DC的标记率约100％，对DC的功能、凋亡无明显影响，72小时内荧光强度无明显减弱。对荷瘤鼠光学成像显示，对照组中小鼠全身未见明显的阳性信号，从第6小时到48小时，小鼠腹部肝脏和脾脏区域出现明显的阳性信号，信号强度有随时间延长逐渐缩小趋势，但在双侧腹股沟和腋窝处未见阳性信号显示，所有成像小鼠移植瘤内均未探测到阳性信号。各脏器离体成像显示，各时间点移植瘤内无信号显示，在对照组小鼠各器官内未见阳性信号，第6小时至48小时，肝脏、肺脏、脾脏和肾脏内有阳性信号并具有逐渐降低趋势，其中，以肝脏内平均信号最强，其次是肺脏、脾脏、肾脏，而心脏、胸腺、脑等器官内未见信号表达。在腹股沟淋巴结、腋窝淋巴结、肠系膜淋巴结均无阳性信号表达。　　结论：近红外染料Cy5.5体外标记DC方法简便、标记效率高，对DC无明显影响。光学成像仪对Cy5.5-DC行体内成像可以清晰显示DC的体内分布状况。尾静脉注射后，DC主要集中分布在肝脏、肺脏、脾脏，体表和腹腔淋巴结未见DC迁移而至。