阳春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果实称为春砂仁,是中药砂仁的主流品种之一,具有较高的药用价值和经济价值。然而,由于阳春砂药源植物生长环境特殊、结实率低等因素,导致其产量低,造成了阳春砂资源的紧缺。MeJA (methyl jasmonate,茉莉酸甲酯)作为一种非生物诱导子,可有效调控药用植物中次级代谢产物的生物合成。阳春砂芳香化湿的主要药效物质成分是挥发油,其主要由挥发性萜类成分组成,而萜类化合物属于次级代谢产物。因此,用MeJA处理阳春砂或将成为提高阳春砂中药效物质成分含量的可靠手段。同时,利用高通量测序技术可初步探究MeJA调控阳春砂萜类代谢的分子机制。1目的通过不同浓度MeJA溶液喷施阳春砂植株的果实和叶片,分析果皮和种子团中挥发性萜类成分的变化情况。运用第二代高通量测序技术,对MeJA诱导后的阳春砂果实和叶片进行RNA-Seq测序,获得MeJA诱导后阳春砂的转录组数据,为后续实验提供参考序列。同时,将不同浓度MeJA诱导的阳春砂果实(分为种子团和果皮)进行表达谱测序,分析不同浓度MeJA喷施阳春砂不同部位后对阳春砂种子团和果皮中基因表达的调控差异,初步探索MeJA调控阳春砂果实中挥发性萜类合成的分子机制。2方法2.1不同浓度MeJA溶液喷施阳春砂后挥发性萜类成分的变化分析通过5个不同浓度的MeJA溶液喷施阳春砂的叶片,分别于处理后不同时间进行采样,用超声法提取叶片中的挥发性萜类成分,用GC-MS检测并分析其变化情况,筛选出适宜浓度的MeJA溶液和处理后的采样时间点。然后用筛选出的200 μmol/L和600μmol/L的MeJA溶液(以溶剂作为对照)分别喷施挂果阳春砂植株的果实和叶片,用微波法提取果皮和种子团中的挥发性萜类成分,并用GC-MS检测果皮和种子团中挥发性萜类成分的变化情况,分析不同浓度MeJA溶液喷施不同时间后对阳春砂不同部位中挥发性萜类成分的调控差异。2.2 200 μmol/L和600 μmol/L MeJA诱导后阳春砂的转录组测序与分析分别提取200 μmol/L和600 μmol/L MeJA诱导后的阳春砂果皮和种子团的总RNA,将不同样品的RNA等量混合处理后,反转录为cDNA构建测序文库,用Illumina HiSeq 2000测序平台进行转录组测序。获得的高质量读序经进一步拼接成Unigenes。将Unigenes的序列与4个公共蛋白数据库做blastx比对,可得到其功能注释信息,并重点分析萜类代谢、JA (jasmonate acid)生物合成和信号转导相关的代谢通路。2.3 200 μmol/L和600 μmol/L MeJA诱导后阳春砂的表达谱测序与分析以转录组数据为参考序列,分别提取200 μmol/L和600 μmol/L MeJA诱导后阳春砂果皮和种子团的RNA,进行RNA-Seq表达谱测序,分析不同表达谱的测序质量,筛选出不同样本间的差异表达基因,并进行两两样品间的比较分析、多样品比较分析、趋势分析等多角度分析,其中重点关注萜类骨架生物合成和JA信号转导途径中基因的差异表达情况。2.4 MeJA诱导后阳春砂果实中部分基因的表达水平及相关性分析结合转录组和表达谱数据中萜类代谢和JA生物合成相关通路中的注释信息,筛选出实时荧光定量PCR实验中内参基因和目的基因对应的候选功能基因,设计引物并验证引物的有效性,优选引物的退火温度,进行RT-qPCR (real-time fluorescence quantitative PCR)实验,分析部分基因的相对表达水平,并结合转录组和表达谱数据进行综合分析。此外,将阳春砂果实中部分萜类代谢相关基因和挥发性萜类成分与JA信号转导途径中的关键基因进行Pearson相关性分析,考察JA信号转导与阳春砂果实中萜类代谢之间的相关性。3结果3.1不同浓度MeJA影响阳春砂中挥发性萜类成分的合成和积累不同浓度MeJA喷施阳春砂叶片后,不同处理组中均检测到7种挥发性萜类成分,包括3个单萜类、3个倍半萜类和1个二萜类成分。从不同浓度MeJA溶液喷施阳春砂24h和相同浓度MeJA溶液喷施阳春砂不同时间两个角度进行分析,结果表明,不同浓度MeJA溶液喷施阳春砂叶片后叶片中挥发性萜类成分的变化情况比较复杂,最终选择200 μmol/L和600 μmol/L MeJA溶液分别喷施挂果阳春砂植株,并于喷施24h和48h后进行采样。用200 μmol/L和600 μmol/L MeJA溶液喷施挂果阳春砂植株,果皮中共检测到20种挥发性萜类成分,其中单萜及其衍生物13种,倍半萜及其衍生物7种；种子团中共检测到33种挥发性萜类成分,其中单萜及其衍生物14种,倍半萜及其衍生物19种。在保证其他实验条件一致的前提下,从喷施不同浓度、喷施后不同的取样时间和喷施不同部位三个角度,分析并讨论果皮和种子团中挥发性萜类成分的变化情况。结果发现,200 μmol/L MeJA喷施果实对阳春砂果皮中挥发性萜类成分的合成具有一定的抑制作用,600 μmol/L MeJA喷果24h能够显著促进阳春砂果皮中挥发性萜类成分的合成。200 μmol/L MeJA喷果可显著促进阳春砂种子团中大部分倍半萜类成分的合成,而600 μmol/L MeJA对阳春砂种子团中挥发性萜类成分的合成具有一定的抑制作用,并且其抑制作用随着时间的推移而逐渐减弱。此外,200 μmol/L MeJA喷施阳春砂叶片可选择性提高果皮中樟脑、龙脑和大牻牛儿-1,6-二烯-5-醇的含量,而喷施阳春砂果实可显著提高果皮中芳樟醇、α-蒎烯、β-蒎烯和桧烯的含量,并可显著提高种子团中大部分挥发性萜类成分的含量。3.2 MeJA影响阳春砂萜类代谢和JA生物合成及信号转导相关基因的转录通过Illumina测序获得了不同浓度MeJA喷施阳春砂果实和叶片后的转录组数据,共得到138,679个unigenes序列,其中有70,323个获得注释,注释率为50.71%。COG (cluster of orthologous groups of proteins)功能分类中,共有27,382个unigenes归到25个功能类别。KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)注释结果表明,共有21,503个unigenes注释到了125个代谢通路中。次生代谢相关的代谢通路‘有21条,包含3398个unigenes(约占16%)。萜类代谢相关通路中注释到299个unigenes,其中单萜合酶基因注释到3个,分别是月桂烯/罗勒烯合酶(myrcene/ ocimene synthase)、芳樟醇合酶((3S)-linalool synthase)和新薄荷醇脱氢酶((+)-neomenthol dehydrogenase);倍半萜合酶基因注释到2个,分别是法尼基焦磷酸法尼基转移酶(farnesyl-diphosphate farnesyltransferase)和角鲨烯单加氧酶(squalene monooxygenase)。此外,还通过反向比对挖掘到9个单萜合酶和7个倍半萜合酶基因。同时,JA生物合成途径中JAR1 (JA-amino acid synthetase1)、JAZ (jasmonate ZIM domain-containing protein)、COI1 (coronatine insensitive protein 1)和MYC2 (transcription factor MYC2)均获得注释,对应61个unigenes。这些migenes为深入研究萜类代谢和JA生物合成以及信号转导的分子机制提供了重要的候选功能基因。3.3 MeJA影响阳春砂萜类骨架合成和JA信号转导相关基因的差异表达两两样品间的比较分析结果表明,不同基因的差异表达对不同浓度MeJA溶液的诱导存在不同的敏感性。萜类生物合成MEP (methylerythritol-4-phosphate)途径中筛选得到了更多的差异表达基因,其中DXS (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase)和HDS (1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate synthase)等基因的表达差异比其他基因更加显著。并且,MeJA可促进种子团中JAZ的上调表达,并且浓度越高促进作用越显著。此外,种子团中JA信号转导相关基因注释到了更多的Unigenes,说明阳春砂种子团中JA信号转导相关基因对MeJA诱导的响应更积极。多样品比较与富集分析结果表明,阳春砂果皮萜类骨架生物合成途径中的基因HMGR (hydroxymethylglutaryl-CoA reductase)、MVK (mevalonate kinase)、DXS、 DXR (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase)、HDR (4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase) 和 GGPPS (geranylgeranyl diphosphate synthase),以及JA信号转导途径中的JAR1和JAZ受MeJA的调控而差异表达。而种子团萜类骨架生物合成途径中DXS、CMK (4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase)、MVK、HDS、GGPPS、DHDDS (ditrans,polycis-polyprenyl diphosphate synthase)和CHLP (geranylgeranyl reductase),柠檬烯和蒎烯降解途径中的CYP71 (Acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen)和ALDH (aldehyde dehydrogenase (NAD+)),倍半萜生物合成途径中的SQLE (squalene monooxygenase),以及JA信号转导途径中的JAR1、JAZ、MYC2亦受MeJA的诱导而差异表达。然而,只有阳春砂果皮中的HMGR以及种子团中的DXS、CMK、JAR1、 JAZ和MYC2对MeJA溶液的浓度不敏感。此外,趋势分析结果表明,不同浓度的MeJA溶液对阳春砂不同组织中萜类骨架生物合成和JA信号转导相关基因的调控存在差异性。3.4 MeJA影响阳春砂果实中部分基因的表达水平阳春砂果皮中JAR1、HMGR、GGPPS和OPR(12-oxo-phytodienoic acid reductase)的表达量较低,而CHLP、HDR、ISPD (2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase)和DXR的表达量较高。溶剂、200μmol/L MeJA溶液和600 umol/L MeJA溶液喷施阳春砂果实24h后,均能显著提高种子团中DXR的表达量,且溶剂的调控作用最显著。不同浓度MeJA喷施阳春砂果实24h后,阳春砂果皮中JAM的表达量是一直显著上升,CHLP、GGPPS和DXR是一直下降,而HMGR、OPR、 ISPD和HDR是先下降后上升,说明MeJA诱导对CHLP、GGPPS和DXR的表达具有一定的抑制作用。阳春砂种子团中JAR1、CHLP、HMGR和GGPPS的表达量较低,而OPR、HDR、ISPD和DXR的表达量较高。溶剂和600 μmol/L MeJA溶液能显著提高种子团中DXR的表达量,200μmol/L MeJA溶液能够显著提高种子团中OPR的表达量。不同浓度MeJA喷施阳春砂果实24h后,阳春砂种子团中HMGR的表达量是一直上升,OPR是先上升后下降,CHLP、HDR、ISPD、GGPPS和DXR是先下降后上升,JAR1是一直下降且均具有显著性,说明MeJA诱导对JAR1的表达起抑制作用。结合转录组和表达谱数据进行比较分析发现,不同浓度MeJA处理后阳春砂果皮和种子团的表达谱中8个目的基因的表达量变化情况与RT-qPCR的结果基本一致。但是,种子团的表达谱中CHLP基因的表达量是先上升后下降,而RT-qPCR结果中CHLP是先下降后上升。此外,阳春砂萜类骨架生物合成以及挥发性萜类生物合成途径中部分基因的表达与JA信号转导密切相关,并且均为正相关。其中,AACT (acetoacetyl-CoA trans ferase)和FDFT (farnesyl-diphosphate farnesyltransferase)与JAZ密切相关,MVD (diphosphomevalonate decarboxylase)与MYC2密切相关,且无组织之间的差异。并且,果皮中与JA信号转导具有极强相关性的萜类合成基因更多。同时,阳春砂果皮中大部分挥发性萜类成分与MYC2具有极强的相关性,而种子团中大部分挥发性萜类成分与JAZ具有极强的相关性。双环榄香烯和大牻牛儿-1,6-二烯-5-醇与JAZ密切相关,叶古巴烯与MYC2密切相关,且无组织之间的差异。其中,乙酸龙脑酯与果皮中MYC2以及种子团中JAZ具有极强的相关性,说明JA信号转导与乙酸龙脑酯的生物合成具有一定的关联性。结论本研究通过不同浓度MeJA喷施阳春砂的叶片和果实,获得了MeJA诱导后阳春砂中挥发性萜类含量变化的数据,并利用RNA-Seq技术获得了MeJA诱导后阳春砂的转录组和表达谱信息,重点分析了萜类代谢和JA信号转导途径中相关基因的差异表达情况,结果发现MeJA可有效调控阳春砂果实中挥发性萜类成分的变化和萜类合成相关基因的差异表达,并且JA信号转导与部分萜类合成相关基因以及挥发性萜类成分之间具有较强的相关性,推测MeJA可通过调控JA信号转导途径中关键酶基因的表达,进而调控萜类合成相关基因的表达以及挥发性萜类成分的合成和积累,这些数据为深入研究MeJA调控阳春砂中萜类代谢的分子机制奠定了基础。