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研究目的：支气管哮喘是严重危害人类健康的常见病和多发病,近年来发病率呈上升趋势。支气管哮喘的三个主要病理改变是气道炎症,平滑肌功能紊乱和气道重塑。其中气道重塑是肺功能受损的病理基础,进而导致劳动力丧失,增加社会医疗负担。揭示哮喘气道重塑的发生、发展机制,寻找治疗靶位,以期早期阻断甚至逆转其病理过程,是改善哮喘预后的关键,也是哮喘研究中的热点与难点。异常的上皮-间质转化反应被认为是哮喘的早期气道重塑病理生理特征的中心环节。在上皮-间质转化(EMT)发生、发展的过程中,上皮化特征的E-Cadherin(E钙粘蛋白)表达减少；而间质化特征的Collagen 1(Ⅰ型胶原)和Fibronectin 1(纤维连接蛋白1)表达增加。我们的前期研究[1]发现：FIZZ1在哮喘动物模型Ⅱ型肺泡上皮细胞内表达增强,并且诱导支气管粘膜下α-SMA过表达,FIZZ 1可诱导α-SMA和Ⅰ型胶原：mRNA和蛋白质表达,进而导致哮喘早期的气道重塑。最新研究显示,FIZZ 1也可以激活PI3 K(Phosphoinositide 3-kinase)/Akt信号通道,导致下游的炎症反应。对于FIZZ 1与PI3 K/AKT的相互作用机制,目前尚不清楚。基于目前国内外气道重塑研究进展,结合我们的初步研究结果,我们提出如下假说：FIZZ 1激活PI3K/Akt信号通路,诱导哮喘气道上皮-间质转化(EMT),产生间质化上皮α-SMA和Ⅰ型胶原沉着,从而激活哮喘早期气道重塑发生。基于以上假设,本实验拟进行如下研究：1.明确FIZZ1在哮喘早期气道重塑中的关键作用；2.验证FIZZ 1调控PI3K/Akt信号转导,进而调控气道上皮EMT的信号通道；3.在小鼠哮喘模型中开展对FIZZ1-PI3K/Akt信号通道靶位治疗的实验研究。研究方法：(1)动物实验：取40只8-10周龄SPF级雌性BALB/c小鼠(体重为20±2g),随机分为对照组(生理盐水+生理盐水)、OVA组(OVA+生理盐水)、LY294002组(OVA+LY294002)和Akt阻断剂-Ⅳ组(OVA+Akt阻断剂-Ⅳ)；分别于第1天和第14天给予腹腔注射OVA+氢氧化铝混悬液致敏,第21-23天小鼠置于自制的有机玻璃盒,给予雾化吸入OVA激发(对照组致敏及激发均用生理盐水代替)；在每一次雾化吸入药物前2小时分别给予鼻内滴入生理盐水(对照组、OVA组)、LY294002(LY294002组)及Akt阻断剂-Ⅳ(Akt阻断剂-Ⅳ组)；最后一次诱喘24小时后应用动物肺功能仪,测定小鼠气道反应性；苏木素伊红(HE)染色观察小鼠肺组织炎症细胞浸润情况；应用免疫组化检测FIZZ1、Ⅰ型胶原、E-钙粘蛋白及纤维连接蛋白-1在哮喘小鼠中的表达；应用western blot检测FIZZ1、p-Akt、α-SMA.I型胶原和β-肌动蛋白的表达；实时定量PCR检测α-SMA和Ⅰ型胶原的表达。(2)体外细胞培养：应用细胞系MLE-12,与FIZZ 1重组蛋白共培养(对照组用PBS)，24小时后用western blot检测Akt的磷酸化水平,以及Ⅰ型胶原和α-SMA的表达；应用细胞系MLE-12,用FIZZ1-shRNA转染,48小时后用western blot检测Akt的磷酸化水平,以及FIZZ1、α-SMAⅠ型胶原的表达。统计学分析：所有实验结果均以均数士标准差(x±s：)表示,采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析,两组间均数比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果：(1)小鼠哮喘模型成功建立的表现：OVA组小鼠在造模过程中出现明显的活动频繁,呼吸急促,腹肌抽搐,大小便失禁,毛发竖起,部分小鼠出现反应迟钝,动作迟缓等表现。OVA组小鼠气道反应性要明显高于对照组(P<0.05)。另外,高倍显微镜下可见OVA组小鼠气道周围有大量的炎症细胞浸润,对照组小鼠肺泡壁结构完整,气道上皮无增厚,气道周围无明显的炎症细胞浸润。(2)小鼠肺组织中FIZZ1和p-Akt的表达水平：通过免疫组化检测发现,OVA组气道上皮中FIZZ1表达明显高于对照组；通过western blot检测发现,OVA组FIZZ1的表达和Akt磷酸化水平均明显高于对照组。(3)体外培养MLE-12细胞系中Akt磷酸化水平以及α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平：为确定FIZZ1是否可以促进Akt磷酸化,体外培养MLE-12细胞系分别给予FIZZ1重组蛋白及FIZZ1shRNA干预,之后采用western blot法检测Akt磷酸化水平以及α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平,结果显示：FIZZ1重组蛋白干预后Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA表达水平以及Akt磷酸化水平明显增高；而FIZZ1-shRNA干预后FIZZ1、Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA表达水平以及Akt磷酸化水平明显下降。(4)鼻内滴入LY294002以及Akt阻断剂-Ⅳ对哮喘小鼠气道炎症的影响：气管内滴入LY294002以及Akt阻断剂-Ⅳ后,高倍镜显微镜下可见炎细胞浸润情况较OVA组明显减轻。(5)鼻内滴入LY294002以及Akt阻断剂-Ⅳ对哮喘小鼠E-钙黏蛋白、纤维连接蛋白-1、Ⅰ型胶原以及α-SMA表达水平的影响：OVA组小鼠呼吸道上皮细胞中纤维连接蛋白-1和Ⅰ型胶原蛋白高水平表达,明显高于对照组；给予气管内滴入LY294002以及Akt阻断剂-Ⅳ后纤维连接蛋白-1和Ⅰ型胶原蛋白表达的水平明显低于OVA组。与此相对比,OVA组小鼠E-钙黏蛋白表达少于对照组；而经LY294002以及Akt阻断剂-Ⅳ干预后,E-钙黏蛋白表达水平明显高于OVA组。OVA组小鼠中Ⅰ型胶原蛋白以及α-SMA的mRNA表达水平以及蛋白表达水平均明显高于对照组；而LY294002和Akt阻断剂-Ⅳ可以明显减少Ⅰ型胶原蛋白以及α-SMA的表达。结论：(1)FIZZ1在哮喘小鼠的肺中高表达；(2)FIZZ1通过调控PI3K/Akt信号转导,进而调控气道上皮EMT的信号通道;(3)应用LY294002以及Akt阻断剂-Ⅳ可以减少气道炎症细胞浸润,增强E-钙黏蛋白表达,降低Ⅰ型胶原蛋白以及a-SMA的表达,减轻哮喘气道重塑。