研究目的:随着生活水平的提高、生存寿命的延长以及环境污染的加重等因素,肿瘤的发病率呈逐步攀升趋势,已与心血管疾病共同构成威胁人类生命的最为重要的疾病,据统计我国每年大约有265万人因肿瘤而失去生命。因此,国内外非常重视对肿瘤的研究,为此投入了巨大的人力和物力。尽管肿瘤诊断技术已取得了巨大的进步,但大多数恶性肿瘤的预后依然很不理想,其主要原因就在于对肿瘤发生机制和生物学特性的认识尚存在不足,临床上缺乏有效的治疗手段。骨肉瘤是起源于间充质细胞的原发性恶性骨肿瘤,在原发性骨肿瘤中,骨肉瘤的发病率仅次于浆细胞骨髓瘤,居第2位,好发于10-25岁青年,男女患者比例约为1.5:1。骨肉瘤的恶性程度很高,生长非常迅速,转移早,侵袭性强,在临床上作出诊断时已有80%左右的患者发生了肺部或其他部位的转移。既往骨肉瘤患者的预后极差,5年生存率仅有20%左右,尽管近年来外科手术和化疗方面取得了长足的进展,但骨肉瘤患者的长期生存率至今仍徘徊在65%左右,多数患者最终仍然死于骨肉瘤的局部复发或远处转移。目前,骨肉瘤的治疗仍是主要针对于肿瘤整体,通过辅助化疗和手术切除去除或杀灭大多数骨肉瘤的肿瘤细胞,但仍很难阻止骨肉瘤的复发和转移。肿瘤干细胞理论的提出为骨肉瘤的发生、转移和侵袭等提供了全新的诠释和治疗方向。该理论认为仅有极少数肿瘤细胞(即肿瘤干细胞)而非全部肿瘤细胞具有致瘤性。肿瘤干细胞和正常干细胞一样多处于静止期,与大多数快速增殖的肿瘤细胞不同,常规放、化疗都不易杀到它,即使99.99%肿瘤细胞都被杀死了,但只要还有0.01%的肿瘤干细胞存活,就将成为今后肿瘤复发的根源。这一理论很好地解释了众多骨肿瘤医师对骨肉瘤复发率居高不下、长期疗效较差的临床困惑。本研究针对骨肉瘤的高复发和转移特性,选取国人骨肉瘤标本,分离、培养骨肉瘤干细胞,获得国人骨肉瘤干细胞的样本,了解骨肉瘤干细胞的致瘤性和转移性,发现骨肉瘤干细胞特异表达基因和蛋白,探索骨肉瘤干细胞特异性标志物的建立,为进一步研究骨肉瘤发病机制、早期诊断及靶向治疗提供依据。研究方法:收集国人新鲜骨肉瘤标本,进行原代培养,采用添加多种不同生长因子的无血清培养技术诱导骨肉瘤球体细胞;应用免疫荧光染色检测骨肉瘤球体细胞中Oct4,Nanog和Sox2的表达,探索并获得具有最佳效果的骨肉瘤球体细胞培养条件;诱导骨肉瘤细胞球;利用流式细胞术检测骨肉瘤球体细胞中CD73、90、105的表达;免疫磁珠法以CD105为标志分选细胞,并对其进行生物学特性研究。结果:1、利用新鲜骨肉瘤标本原代培养,获得国人骨肉瘤细胞,并进行传代培养。2、原代骨肉瘤细胞在无血清培养基中生长,分别加入四组生长因子,第一组:EGF、IGF-1;第二组:EGF、bFGF;第三组:EGF,IGF-1,TGF-β1;第四组:EGF、TGF-β1、bFGF,每组都成功诱导骨肉瘤球体形成;应用细胞免疫荧光检测四组骨肉瘤球体细胞中Oct4、Nanog和Sox2蛋白的表达,第四组中Oct4、Nanog和Sox2蛋白在多数细胞中阳性表达,其余三组中Oct4、Nanog和Sox2蛋白只在少数细胞中阳性表达。3、流式细胞术检测骨肉瘤球体细胞中CD73、CD90、CD105的表达,CD73阳性率为95.5%,CD90阳性率为93.9%,CD105阳性率为1.4%。4、免疫磁珠法以CD105为标志分选骨肉瘤球体细胞,得到CD105~+及CD105~-骨肉瘤细胞,并分别接种培养,CD105~+的细胞可形成明显的细胞球。细胞免疫荧光法分别检测CD105~+及CD105-骨肉瘤球体细胞中RunX2、Osx、Oct4、Sox2、Nanog蛋白的表达,CD105~+细胞中RunX2、Oct4、Sox2、Nanog在多数细胞中阳性表达,Osx在多数细胞中阴性表达。CD105-细胞中RunX2、Osx、Oct4、Sox2、Nanog几乎无表达。5、细胞侵袭实验、细胞增殖实验及成瘤实验结果发现CD105~+细胞具有较强的侵袭性、增殖能力,能够在小鼠体内成瘤。结论:利用新鲜骨肉瘤标本培养并获得原代国人骨肉瘤细胞标本,原代骨肉瘤细胞在添加细胞因子EGF、TGF-β1、bFGF的无血清培养基中可诱导骨肉瘤细胞球体,免疫荧光法检测表明该细胞中多数细胞阳性表达Oct4、Nanog和Sox2蛋白,流式细胞术检测发现CD105可能是骨肉瘤干细胞重要的表面标志,以CD105为表面标志应用免疫磁珠法分选出其中的CD105~+细胞,发现其表达RunX2、Oct4、Sox2、Nanog蛋白,不表达Osx蛋白,细胞侵袭实验、细胞增殖实验及成瘤实验结果发现CD105~+细胞具有较强的侵袭性、增殖能力,能够在小鼠体内成瘤,表明本次试验所分离培养的骨肉瘤细胞具有干细胞特性。