猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种病毒性肠道传染病。自2010年底,由PEDV变异毒株引起的PED大规模暴发,给全球养猪业带来了严重的经济损失。目前尚无有效的药物用于该病的治疗,因此抗PED药物的开发成为研究热点。PEDV 3C样蛋白酶(3CL^pro)在PEDV增殖及致病过程中发挥关键作用,且在PEDV不同变异毒株中具有较好的保守性,因此,PEDV 3CL^pro可以作为开发抗病毒药物的重要靶标。而PEDV 3CL^pro和底物间相互作用机制的阐明将为靶向PEDV 3CL^pro特异性药物的研制提供理论依据。本实验室前期的分子生物学实验研究发现,PEDV 3CL^pro可以识别天然免疫信号通路中关键分子-NEMO的第231位（P1）谷氨酰胺并对其进行切割,当NEMO切割位点邻近的第229位（P3）谷氨酰胺突变为精氨酸（Q-P3-R）、赖氨酸（Q-P3-K）或丙氨酸（Q-P3-A）后,发现Q-P3-A突变体完全不能被PEDV 3CL^pro切割,而Q-P3-K和Q-P3-R突变体被PEDV 3CL^pro切割的程度减弱,表明P3位点的突变会影响NEMO被PEDV 3CL^pro识别和切割,提示NEMO P3位在PEDV 3CL^pro识别底物自身底物过程中可能具有某些特殊作用。但是,P3位氨基酸是如何影响底物被PEDV 3CL^pro识别的机制尚不清楚,因此,本论文利用分子动力学模拟针对PEDV 3CL^pro与NEMO之间的相互作用开展了以下研究:1.Western blot实验分析PEDV 3CL^pro识别NEMO P3位的特征有文献报道冠状病毒3CL^pro底物P3位偏爱正电荷氨基酸和长侧链氨基酸,我们在分析PEDV 3CL^pro底物P3位偏爱性时,发现P3位偏爱性最高的氨基酸为天冬酰胺（N）。基于此,我们构建了NEMO 229（QP3）位突变的2个突变体:Q-P3-E和Q-P3-N,将这两个突变体的真核表达质粒和实验室之前构建的NEMO野生型（WT）及3个突变体（Q-P3-A、Q-P3-K、Q-P3-R）的真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,通过Western blot实验检测不同转染体系中PEDV 3CL^pro对NEMO的切割程度。发现WT（无电荷、长侧链）、Q-P3-K（正电荷、长侧链）、Q-P3-R（正电荷、长侧链）可以被PEDV 3CL^pro切割,而Q-P3-A（无电荷、短侧链）不能被PEDV 3CL^pro切割,与本实验室前期实验结果相符;此外,Q-P3-E（负电荷、长侧链）及Q-P3-N（无电荷、长侧链）也可以被PEDV 3CL^pro切割,说明PEDV 3CL^pro底物NEMO P3位也可以是负电荷氨基酸。进一步分析发现在可以发生切割反应的体系的中,底物NEMO P3位均具有长侧链的特征,提示PEDV 3CL^pro底物NEMO P3位可能偏爱长侧链氨基酸。2.NEMO P3位点不同突变体与PEDV 3CL^pro间的自由能分析分子生物学实验是进行分子动力学研究的基石,而分子动力学研究可以从微观角度上观察到模拟体系原子尺度上的运动变化。为探究NEMO P3位点不同突变对PEDV 3CL^pro识别底物的影响,我们借助分子动力学模拟分析了NEMO野生型（WT）及5个突变体（Q-P3-A、Q-P3-K、Q-P3-R、Q-P3-E和Q-P3-N）与PEDV 3CL^pro间的自由能。发现Q-P3-A与PEDV 3CL^pro间的自由能值最大,说明Q-P3-A体系中酶与底物的亲和力最低,发生切割反应的可能性最小,与生物学实验证实Q-P3-A是唯一不能被切割的结果是一致的。3.NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV 3CL^pro的切割有文献报道:冠状病毒3CL^pro底物P3位偏爱可以形成β-sheet结构的氨基酸,而PEDV也属于冠状病毒,因此,我们利用分子动力学模拟分析了不同突变体P3位点及其邻近氨基酸的二级结构变化,发现在可以发生切割反应体系中的NEMO（WT、Q-P3-K、Q-P3-R、Q-P3-E、Q-P3-N）均存在由P3、P2形成的β-sheet结构;但是,在无切割反应发生的体系中的NEMO（Q-P3-A）则不存在由P3、P2形成的β-sheet结构,表明NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV 3CL^pro的切割。进一步利用分子动力学模拟分析了6个体系中底物P3、P2位β-sheet结构存在的时间,发现在WT、Q-P3-N、Q-P3-K中,P3、P2位的二级结构始终为β-sheet,在Q-P3-R中,P3、P2位的二级结构由β-sheet逐渐转变为loop,在Q-P3-E中,P3、P2位的二级结构由loop逐渐转变为β-sheet,而在Q-P3-A中,P3、P2位的二级结构由β-sheet很快转变为loop,表明NEMO P3位的突变会影响P3、P2位β-sheet结构的形成和维持。4.NEMO P3位点的突变影响PEDV 3CL^pro酶活位点H41和C144间的距离在证实NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV 3CL^pro的切割后,利用分子动力学模拟对其作用的具体机制进行了分析。发现当底物P3、P2位二级结构由β-sheet转变为loop时,底物P2位氧原子构象由溶剂化表面翻转至PEDV 3CL^pro酶活口袋方向,底物P2位氧原子构象的变化又导致PEDV 3CL^pro上S2口袋氨基酸中H41的构象发生了改变,而H41构象的改变,则导致了其与另一个酶活位点C144间的相对定位发生了改变。而PEDV 3CL^pro酶促反应的第一步是H41上的N夺取C144上-SH的H,暗示H41和C144间的距离对酶促反应的发生至关重要。因此,进一步分析了PEDV 3CL^pro H41和C144间参与酶促反应的重原子间距,发现在不同体系中,H41和C144间的距离波动差异明显,表明NEMO P3位的突变会影响PEDV 3CL^pro酶活位点H41和C144间的距离。此外,我们分析了酶活位点间距和NEMO的切割程度间的相关性,发现二者的相关性系数为0.846,表明二者之间具有强相关作用,说明PEDV 3CL^pro中H41和C144间的合适距离是影响其对NEMO切割的重要因素。