【摘 要】
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细胞周期调控主要是通过蛋白质激酶介导的信号转导完成的,而Cyclin-CDK蛋白激酶复合体又为其中最为关键的调控分子.不同的Cyclm-CDK复合体在细胞周期的不同时相发挥不同的作
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细胞周期调控主要是通过蛋白质激酶介导的信号转导完成的,而Cyclin-CDK蛋白激酶复合体又为其中最为关键的调控分子.不同的Cyclm-CDK复合体在细胞周期的不同时相发挥不同的作用.CyclinE/CDK2复合体在细胞周期的G1/S转换过程中扮演着非常重要的角色.目前已经发现一些分子与Cyelin/CDK2激酶复合体相互作用而调节细胞周期的过程.但是Cyclin/CDK2调控细胞周期详尽的作用机制尚未明晰.
本研究利用TAP(Tandem Affinity Pufification,TAP)亲合纯化技术筛选了与CDK2相互作用的蛋白-Ankrd17,且已证明该蛋白为CyclinE/CDK2的底物.本文旨在研究Aukrd17蛋白在细胞周期中的功能.首先,通过RT-PCR的方法检测Ankrd17在人正常组织、正常细胞株及肿瘤细胞株中基因的表达水平,发现Ankrd17基因在人不同正常组织、正常及肿瘤细胞中均有表达,且在细胞周期不同时段表达水平基本恒定.其次,构建了人源Ankrd17基因的真核表达载体,并在哺乳细胞HCT116中进行过量表达.采用表达EGFP的质粒和目的基因Ankrd17共转染HCT116细胞的方法,筛选阳性细胞分析当Ankrd17与CyclinE/CDk2相互作用时其在细胞周期G1/S转换中的作用.实验结果表明,在HCT116细胞中过量表达Ankrd17蛋白对细胞周期有明显的促进作用.再次,构建了的CyclinA1的原核表达载体,并进行了GST-CyclinA1融合蛋白的表达纯化,以待通过体内、体外结合实验和体外激酶反应证实其是否为CyclinA/CDK2的功能性底物.同时,筛选Ankrd17基因有效的RNAi逆转录病毒载体,以待构建Aukrd17蛋白缺失的HCT116的稳定细胞株,并观察Ankrd17在细胞周期中的功能.
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