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研究目的:医用臭氧引起的过氧化损伤可以导致脊髓神经毒性,但其机制尚不十分清楚。机体氧化-抗氧化平衡的破坏增加了细胞内未折叠或错误折叠蛋白的堆积,引起内质网应激。过度的内质网应激可以导致细胞凋亡。本研究拟通过体内实验中评价臭氧对大鼠脊髓神经细胞中内质网应激相关蛋白表达的影响,探讨内质网应激(ER Stress)在医用臭氧导致的大鼠脊髓神经毒性中可能发挥的作用,全面认识医用臭氧对机体的过氧化损伤机制,指导医用臭氧正确合理的临床应用。研究方法:1.实验动物将36只健康清洁级成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组(n=12),分别建立大鼠鞘内置管给予臭氧模型(模拟椎间盘内和椎间孔硬膜外腔臭氧注射治疗中臭氧进入蛛网膜下腔的过程)。对照组只进行鞘内穿刺置管不注射医用臭氧,实验组鞘内置管后分别经导管注射30 μg/mL(低浓度组)和60μg/mL(高浓度组)医用臭氧10μL。2.蛋白质免疫印迹法检测医用臭氧鞘内注射后24小时,每组随机选取3只大鼠,腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉后断颈取材,使用蛋白质免疫印迹法检测脊髓组织内内质网应激标志性伴侣蛋白GRP78、内质网-线粒体界面上的分子伴侣Sigma-1受体(Sigma-1R)、内质网途径凋亡相关蛋白CHOP及Caspase-12的表达情况。3.形态学检测在鞘内注射医用臭氧后第3天,每组随机选取3只大鼠,腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉后,心脏灌注4%多聚甲醛后取材,将取出的脊髓组织石蜡包埋、切片、HE染色后光镜下观察各组大鼠脊髓组织是否发生形态学变化。4.运动功能评价所有大鼠在注射医用臭氧前及注射后12天,每日对大鼠进行步态评分的评估及记录。研究结果:1.蛋白质免疫印迹法检测结果显示:与对照组相比,鞘内注射低浓度和高浓度医用臭氧后24小时,脊髓神经细胞中内质网应激相关蛋白GRP78、Sigma-1受体和CHOP的表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05),鞘内注射低浓度臭氧后24小时,Caspase-12的表达未见明显变化(P>0.05),鞘内注射高浓度臭氧后24小时,Caspase-12的表达水平增加,差异有统计学意义。2.大鼠脊髓组织HE染色后形态学观察结果显示:对照组大鼠脊髓神经细胞和胶质细胞分布均匀,脊髓结构完整,灰白质清晰。低浓度和高浓度组均可观察到大鼠脊髓结构的改变,灰白质分界不清,脊髓神经数目减少,神经细胞固缩。3.大鼠运动功能评价结果显示:鞘内注射医用臭氧前,大鼠步态评分分值差异无统计学意义;与对照组相比,鞘内注射低浓度和高浓度医用臭氧后,低浓度和高浓度组大鼠步态评分升高,且高浓度组分值高于低浓度组分值,差异均有统计学意义(P<0.05);高浓度组大鼠后肢运动功能恢复时间长于低浓度组。研究结论:体内实验中,低浓度和高浓度的医用臭氧都可以引起脊髓神经元发生内质网应激并最终导致细胞凋亡,导致大鼠脊髓结构和运动功能发生不同程度的损伤。其机制可能是低浓度医用臭氧激活CHOP途径的细胞凋亡;而高浓度医用臭氧可以激活CHOP和Caspase-12途径的细胞凋亡。