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目的:类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性关节滑膜炎症为主，累及多脏器多系统的常见自身免疫性疾病。RA影响了世界上0.5％～1.0％的人群，发病2年内，约有75％的患者出现关节损害，以侵蚀性滑膜炎为主要特征，关节病变不可逆，全身多个系统受累，给患者身心带来了极大的损害。目前RA的病因及发病机制尚不完全明确，可能为外源性感染作用于遗传易感个体，导致机体免疫系统功能紊乱，进而引起关节滑膜、软骨慢性炎症和破坏。近年来随着对RA的深入研究，发现细胞因子网络在RA发病过程中起到重要作用。 研究发现，滑膜血管新生是RA早期重要的病理改变，促进了血管翳形成、持续的白细胞浸润、滑膜增生，导致了软骨和骨的破坏。血管翳是RA病变过程中一个特征性的病理产物，出现在绝大多数RA患者病变关节腔内，主要由新生微血管、增生肥大的滑膜细胞、炎性细胞及机化的纤维素构成，是引起关节病变、软骨破坏的主要病理基础。新血管生成被认为是形成和维持RA血管翳的一个重要因素。目前抑制血管生成的药物被证实可有效缓解RA的病情。多种细胞因子在血管生成的启动和发展中起关键作用，因此研究细胞因子在RA血管新生中的作用具有切实的临床意义。 白细胞介素-35(interleukin，IL-35)作为IL-12家族的新成员成为RA研究的新热点，它被认为是一种免疫抑制性细胞因子，研究数据正在积累。前期研究发现，RA患者血清IL-35水平显著低于健康对照组，且与关节炎侵蚀性成负相关;用DBA/1小鼠建立胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型研究IL-35对其影响，结果显示用IL-35处理的小鼠关节炎临床症状减轻，说明IL-35能有效缓解CIA的关节炎症并阻止关节破坏。在动物模型中IL-35除了通过抑制Th1和Th17细胞分化，促进CD39在CD4+T细胞内的表达，促进了IL-10的生成拮抗IL-17，抑制自身免疫的效应，延缓和阻止自身免疫性关节炎的进展。研究还发现IL-35可使CIA模型小鼠滑膜中炎症细胞浸润、滑膜增生和血管翳形成减少，伴随着VEGF等表达下调，表明IL-35可能抑制了CIA小鼠滑膜增生和血管翳形成。IL-35是否参与血管新生， IL-35参与血管新生的机制如何目前尚未清楚。 研究发现，RA滑膜组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、VEGF受体VEGFR-1、VEGFR-2表达增多。RA滑膜组织髓细胞和成纤维细胞释放了VEGF、促血管生成素(angiopoietin，Ang)1、Ang2、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等血管生成因子，驱动和维持了RA血管新生。其中VEGF是最关键的促血管生成因子，它促进了内皮细胞增殖、迁移、血管形成。Ang1、Ang2及其受体Tie2在生理和病理性血管生成中也起到重要作用。Ang1、Ang2及其受体Tie2在CIA小鼠中表达显著增加。阻断Tie2能够抑制CIA的发病和严重性，阻止骨破坏。Ang/Tie2通路能够调节RA中肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor alpha，TNF-α)、IL-6、toll-like receptor(TLR)2的促血管生成作用。说明Ang2/Tie2通路在RA血管新生中起重要作用。 综上，本研究将探究IL-35是否对血管新生有影响，是否通过VEGF、Ang2/Tie2通路影响血管新生。 方法:以人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)为研究对象，光镜及免疫荧光鉴定HUVEC细胞，应用CCK-8法检测IL-35作用后HUVEC的细胞增殖率;应用AnnexinV法和流式细胞技术检测IL-35作用后HUVEC细胞凋亡率;用ELISA法检测IL-35处理HUVEC后VEGF蛋白的表达情况;用real-timePCR法，检测IL-35作用后HUVEC细胞VEGF的mRNA的表达情况。通过划痕实验、Transwell侵袭实验、细胞粘附实验、管腔形成实验检测IL-35对VEGF诱导HUVEC血管新生作用的影响，并进一步检测IL-35对Ang2/Tie2信号诱导HUVEC血管新生作用;通过ELISA法检测VEGF对IL-35诱导HUVEC的Ang2蛋白表达的影响。选取C57BL/6雄性小鼠作为研究对象，通过皮下注射制造基质胶塞模型，取出胶塞，通过Drabkin法和HE染色法，检测IL-35对体内血管新生作用的影响。 结果:1、IL-35对HUVEC细胞增殖影响结果显示:IL-35各处理组在各个时间点的HUVEC细胞增值率均小于1，且随时间和剂量升高而递减(P＜0.01)，48 h与72 h差异无统计学意义;2、IL-35对HUVEC细胞凋亡影响结果显示，IL-35各组HUVEC凋亡率均大于对照组，且随时间和剂量升高而递增(P＜0.05);3、ELISA检测IL-35对HUVEC的VEGF蛋白表达的影响实验结果显示，IL-35各组中HUVEC中VEGF蛋白含量显著低于对照组，且具有剂量效应关系(P＜0.05);4、real-time PCR检测IL-35对HUVEC的mRNA表达的结果显示，IL-35各组HUVEC中VEGF的mRNA的表达显著低于对照组，且具有剂量效应关系（P＜0.05）;5、划痕实验检测IL-35对VEGF诱导的HUVEC迁移结果显示，VEGF组迁移的划痕细胞未覆盖的面积显著小于对照组; VEGF+IL-35各组划痕细胞未覆盖的面积显著大干VEGF组（P＜0.01），且具有剂量效应关系;6、侵袭实验检测IL-35对VEGF诱导的HUVEC侵袭结果显示，VEGF组侵袭到膜下层的HUVEC细胞数显著多于对照组(P＜0.01)，VEGF+IL-35各组侵袭到膜下层的细胞数显著低于VEGF组，且具有剂量效应关系（P＜0.01）;7、粘附实验检测IL-35对VEGF诱导的HUVEC粘附结果显示，VEGF组吸光度值显著高于对照组(P＜0.05)，VEGF+IL-35各组吸光度值显著低于VEGF组，且具有剂量效应关系(P＜0.05);8、ELISA法检测IL-35对VEGF诱导的HUVEC的Ang2表达的影响结果显示，VEGF组Ang2浓度显著高于对照组(P＜0.01)，VEGF+IL-35组Ang2浓度显著低于VEGF组(P＜0.05);9、管腔形成实验检测IL-35对VEGF诱导的HUVEC体外管腔形成影响结果显示，VEGF组HUVEC细胞网状结构显著多于对照组(P＜0.01)，VEGF+IL-35各组细胞网状结构显著少于VEGF组，且具有剂量效应关系(P＜0.05);10、基质胶塞实验检测IL-35对VEGF诱导的小鼠体内血管生成的影响结果显示，VEGF组基质胶塞的Hb浓度显著高于对照组(P＜0.01)，VEGF+IL-35组Hb浓度显著低于VEGF组(P＜0.01);11、Ang2/Tie2通路实验部分显示，VEGF+anti-Tie组与VEGF+IL-35组HUVEC迁移细胞数、侵袭细胞数、粘附实验吸光度、网状结构均显著低于VEGF组(P＜0.05);Ang2组的迁移细胞数、侵袭细胞数、粘附实验吸光度、网状结构与VEGF组无显著差异(P＞0.05);Ang2+IL-35组迁移细胞数、侵袭细胞数、粘附实验OD值、网状结构均显著低于Ang2组(P＜0.05)。 结论:1、IL-35抑制HUVEC细胞增殖;2、IL-35促进HUVEC细胞凋亡;3、IL-35抑制HUVEC中VEGF蛋白表达;4、IL-35抑制了HUVEC中VEGF的mRNA的表达;5、IL-35抑制VEGF诱导HUVEC细胞迁移、侵袭、粘附和管腔形成;6、IL-35抑制VEGF诱导HUVEC中Ang2表达;7、IL-35对体内血管形成具有抑制作用;8、IL-35与anti-Tie2相似地抑制了VEGF诱导HUVEC细胞迁移、侵袭、粘附和管腔形成;Ang2与VEGF相似地促进了HUVEC细胞迁移、侵袭、粘附和管腔形成;IL-35抑制了Ang2对HUVEC细胞迁移、侵袭、粘附和管腔形成的促进作用。综上，IL-35抑制了VEGF、Ang2/Tie2促进的血管新生作用。