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目的 ①评价大鼠颈动脉再狭窄模型内膜增生和重塑对再狭窄的作用。②观察PTA后胶原含量在血管壁各层随时间的演变规律，观测其超微结构改变，探讨胶原在血管再狭窄过程中的表达及意义。③观察PTA后MMP-2、MMP-9、TIMP-1在血管壁各层的分布及动态变化特点，分析其与胶原变化、血管VSMC增殖之间的关系，探讨MMPs在血管再狭窄过程中的变化及作用。 材料和方法 1、动物模型和分组 SD雄性大鼠48只，实验侧颈总动脉改良导丝法制作再狭窄模型，对侧假手术颈总动脉为对照组，每组取动脉损伤后1天、3天、7天、14天、28天和42天6个观察时间点，每个时间点8只大鼠。根据HE染色标本，实验侧选血管结构保留完整、内膜增生较满意的30只动物标本，保证各时间点有5只动物，对照侧随机选取5只动物标本作对照进行后续各种染色及处理。 2、病理学检查 所有标本行HE染色，对胶原纤维进行Masson三色染色法和Van Gieson染色法两种方法进行染色，对PCNA、α-Smooth-Actin、MMP-2、TIMP-1进行免疫组织化学染色，MMP-9进行免疫组织化学和原位杂交两种染色。选取对照组、7、14、28、42天中标本各两块进行电镜检测，观察胶原的超微结构动态变化。 3、病理学资料的图像分析 采用病理图像分析系统对标本HE染片进行形态计量分析。分析胶原面积占分析面积的百分比作为胶原密度，以胶原积分光密度和胶原面积比值为胶原平均光密度，以此2指标衡量胶原随时间的动态变化。分别计数PCNA、MMP-2、MMP-9、TIMP-1免疫组化染片和MMP-9天津医科大学博士学位论文原位杂交染片内膜、中膜、外膜阳性细胞率衡量各自的表达。结果一、内膜增生和重塑与血管再狭窄的关系 1、动脉损伤后l天、3天，中膜见损伤改变，厚度及面积略小，外膜增生，厚度及面积增加，中膜、外膜细胞发生表型转换，PCNA表达达高峰。第7天，内膜开始形成，PCNA表达达高峰，Q一Smooth一Actin在外膜一过性表达;中膜面积、厚度基本恢复正常，外膜面积、厚度达高峰，中膜、外膜PCNA表达逐渐下降。第14天，内膜增厚，管腔狭窄，ECM增多，PCNA表达进一步下降，“一Smoot卜Actin表达增多。第28、42天，内膜明显增厚并基本稳定，管腔明显狭窄，外膜厚度、面积恢复正常，中膜萎缩，细胞表型恢复收缩型，内皮细胞覆盖管腔。 2、再狭窄过程中，管腔丢失面积大于内膜面积，在第7、14、28、42天，内膜面积分别占管腔丢失面积的51.12%、65.21%、77.86%、75.02%，平均67.30%。外弹力板围绕面积也明显下降，在第7、14、28、42天分别占管腔丢失面积25.54%、20.24%、20.56%、22.42%，平均22.19%。 3、管腔丢失面积、内膜面积及外弹力板面积三者间有明显相关性，三者之间建立了多元回归方程Y=34.973+0 .877 XL+1 .450 XZ(Y为管腔丢失面积，X【为内膜面积，XZ为外弹力板减少面积，X，、XZ均P<0 .001)，经标准化后，其标准化系数分别为0.624、0.496。 4、管腔面积丢失率、内膜面积增长率及外弹力板面积缩小率三者间有明显相关性，三者之间建立了多元回归方程Y=1.281+0.867X:+1.764x2(Y为管腔面积丢失率，x;为狭窄率，xZ为外弹力板面积缩小率，x;、XZ均P<0 .001)，经标准化后，其标准化系数分别为0.626、0.492。 二、胶原在血管再狭窄中的表达及意义 1、本组MaSSon染色显示，胶原在正常血管主要集中在外膜，占外膜单 位体积的49.31%，中膜胶原含量较少，占中膜单位体积的20.38%。 2、内膜的胶原从第7天内膜开始出现即开始表达，随内膜体积增大， 胶原含量明显增加，第28天基本稳定。中膜胶原含量在整个过程中平均值略 有起伏，但各组间无统计学差异。外膜胶原PTA后开始逐步增加，到第7天 2天津医科大学博士学位论文达高峰，以后均值逐渐下降，虽与第7天无明显差异，但仍高于正常。 3、内膜、外膜胶原密度分别与内膜、外膜面积有相关性，而中膜胶原密度与中膜面积无相关性。内膜、中膜、外膜胶原密度都与管腔面积丢失率具有明显的相关性。中膜、外膜胶原密度与外弹力板面积缩小率具有明显的相关性，而内膜胶原密度与外弹力板面积缩小率无相关性。内膜、外膜胶原密度与内膜面积增长率具有明显的相关性，而中膜胶原密度与内膜面积增长率无相关性。中膜、外膜胶原密度都分别与中膜、外膜PCNA标记指数(PCNALI)无相关性，而内膜胶原密度与内膜PCNALI有负相关性。 4、内膜胶原平均光密度在内膜刚开始形成的第7天即达高峰，随后逐步下降。中膜胶原平均光密度平均值整个过程中变化不大，无显著差异。外膜的胶原平均光密度PTA后第1天即开始上升，到第7天达高峰，随后逐步降至对照水平。 5、电镜发现中膜、内膜胶原失去成熟胶原的周期结构，具有周期结构的成熟胶原含量逐步减少，到第42天，几乎全部为负染胶原。三、恻P一2、MMP一9、TIMP一1在血管再狭窄中的表达和意义 1、正常血管不表达MMP一9 mRNA。损伤后第1天中膜表达逐渐增加，外膜可见少量表达，第3天中膜、外膜表达达高?