【摘 要】
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该实验将PEA功能区Ⅰa、功能区Ⅱ基因片段和H基因片段连接,并构建原核表达载体,进一步获得嵌合蛋白,作为基因转染的广泛DNA载体蛋白旨在建立一种真核基因转染的新方法.从已构
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该实验将PEA功能区Ⅰa、功能区Ⅱ基因片段和H<,3>基因片段连接,并构建原核表达载体,进一步获得嵌合蛋白,作为基因转染的广泛DNA载体蛋白旨在建立一种真核基因转染的新方法.从已构建的pCDPT<,2>质粒（含PEA合序列,由该室保存）中亚克隆获得PEA功能区Ⅰa及功能区Ⅱ基因片段（1100bp,含起始密码子）;提取人染色体DNA,以此为模板扩增获得了人组蛋白H<,3>基因片段（416bp）.将两基因片段分别克隆入pMD-18T载体中,提取克隆质粒;克隆质粒pMD-18T-PEA经NcoⅠ、MluⅠ双酶切,回收酶切产物;克隆质粒pMD-18T-H<,3>经MluⅠ、XhoⅠ双酶切,回收酶切产物.将PEA、H<,3>酶切产物连接,并以正确阅读框架插入经NcoⅠ、XhoⅠ酶切并回收的pET-28A原核表达载体中,经酶切分析及PCR检测,筛选到阳性克隆,其质粒测序结果表明成功地构建了毒性基因缺失的PEA与人组蛋白H<,3>融合基因的原核表达载体.提取重组质粒并转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,对菌体总蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot分析,结果表明BL21（DE3）能有效表达目的蛋白,薄层蛋白扫描计算分析,显示表达蛋白带密度积分占总蛋白量的16.28﹪.大量诱导培养表达菌,制备包涵体,经侧带法纯化后加入弗氏佐剂制成免疫原,对獭兔进行3次（每次间隔14d）注射免疫,通过ELISA法测定,该重组蛋白能够诱导獭兔产生抗体,免疫后7～14d达到峰值,并初步制备了终点滴度为1：1600的兔抗PEA-H<,3>抗血清.从而为进一步的重组蛋白功能分析和基因转染实验奠定了基础.
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