背景及目的恶性黑色素瘤简称恶黑(Malignant Melanoma,MM),是一种高度恶性肿瘤。其主要起源于黑色素细胞,多见于皮肤及粘膜。皮肤恶性黑色素瘤(Cutaneous Malignant Melanoma,CMM)与其他体表肿瘤相比,侵袭及转移最具特征性,也是影响患者预后最重要的原因。CMM侵袭转移机制异常复杂,是由多种致病因素、多个发病步骤及阶段共同作用的结果。Liotta提出的恶性肿瘤细胞转移的三步假说即粘附、降解、移动。包括原发灶处肿瘤细胞的脱落,通过各种作用机制进入血运及淋巴管中播散,随后在其他器官组织处粘附,之后通过分泌相关因子加速新生血管生成并增强肿瘤细胞对机体免疫系统的对抗作用,最终形成新的恶性肿瘤病灶。目前各项有关研究表明其中尤为重要的因素是其相关癌基因的激活及其抑癌基因表达降低或消失,引起癌细胞增殖及侵袭能力增强而致病。因此针对恶黑的各种癌基因及抑癌基因作为靶点的基因治疗逐渐成为一个有效治疗方法。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1,Tiam1)编码的Tiam 1蛋白是一系列Roh样GTPase的鸟苷酸转换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)。Tiam1主要能参与GDP与GTP的转化过程中,从而进一步影响微管蛋白的聚合和解聚;另外进一步激活Rac 1(Ras相关的C3肉毒素底物1),参与JNK激酶(c-jun N-terminal kinase)、p38 MAPK激酶(mitogen activated protein kinase)等下游信号分子转导。通过上述作用机制对机体的细胞骨架进行调节,参与细胞的形变及伪足的形成,增强细胞的运动、迁移能力。同时对微管蛋白进行调控并与其他基因协同作用共同影响细胞的增殖与凋亡。在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移过程中起到重要作用。转移抑制因子23(non-metastasis 23 homologue 1,Nm23-h1)基因是近来研究较多的一个基因。Nm23-h1的生物活性主要通过其编码蛋白产物核苷二磷酸激酶(NDPK)来实现。NDPK一方面直接参与微管蛋白的聚合与解聚从而调节细胞有丝分裂及细胞运动;另一方面NDPK通过多种方式参与G蛋白的信号转导通路,介导细胞的增殖与形态变化;另外其与Rho家族成员广泛藕联,通过对下游基因的表达调控来影响肿瘤细胞的增殖及浸润。本实验通过RT-PCR法了解Tiam1及Nm23-h1在A375细胞和正常皮肤组织细胞中的转录水平差异,利用免疫组化方法检测Tiam1及Nm23-h1蛋白在皮肤恶性黑色素瘤、皮肤交界痣和正常皮肤组织中的表达。初步探究其与恶性黑色素瘤侵袭转移能力的相关性,并进一步了解Tiam1与Nm23-h1之间的相关作用。此次研究在于揭示Tiam1及Nm23-h1在恶性黑色素瘤发生、发展过程中的变化规律,为临床基因靶向治疗恶黑提供实验依据。材料与方法采用RT-PCR法检测Tiam1及Nm23-h1m RNA在A375细胞及正常皮肤组织细胞中的转录水平差异。运用SPSS17.0统计学软件进行实验数据分析,运用t检验法,有统计学意义的α=0.05,P<0.05。收集2010~2014年期间郑州大学第一附属医院病理科存档的皮肤恶性黑色素瘤蜡块66例,交界痣30例。年龄22~76岁不等,平均年龄58.8±9.2岁;男性36例,女性30例;对照组所采用的正常皮肤组织20例来自于郑州大学第一附属医院整形外科手术切除的多余正常全厚皮肤组织。以上所有实验对象具有完整的病史资料,无相关疾病病史,也未行相关如冷冻、化学药物、激光及放射等治疗。各组患者性别、年龄及病变部位等差异无统计学意义(P>0.05)。66例CMM、30例皮肤交界痣和20例正常皮肤组织中Tiam1及Nm23-h1蛋白的表达水平采用免疫组化法进行检测。采用SPSS17.0统计学软件对实验数据进行分析,运用卡方检验和pearson法相关性分析,有统计学意义的α=0.05,P<0.05。结果1.人正常皮肤组织及人恶性黑色素瘤A375细胞中Tiam1 m RNA相对表达量分别为1.001±0.074、2.546±0.357,正常皮肤组织及A375细胞中Nm23-h1m RNA相对表达量分别为0.999±0.034、0.953±0.022。Tiam1 m RNA在人恶性黑色素瘤A375细胞中的表达明显高于其在人正常皮肤组织中的表达;Nm23-h1m RNA在人恶性黑色素瘤A375细胞中的表达低于其在人正常皮肤组织中的表达,其差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.Tiam1蛋白主要表达于细胞质,呈棕褐色颗粒。Tiam蛋白在CMM、皮肤交界痣及正常皮肤组中阳性表达率分别为78.79%(52/66)、46.67%(14/30)和10.00%(2/20),呈逐渐降低趋势,差异具有统学意义(P<0.05)。三组间两两比较显示:CMM组中Tiam1蛋白阳性表达明显高于其在皮肤交界痣中的阳性表达,其在交界痣的表达明显高于正常皮肤组织中的表达(P<0.05);在CMM中随肿瘤浸润深度的增加Tiam1蛋白的阳性表达也逐渐增高,在伴有淋巴结转移的CMM患者中Tiam1蛋白表达水平高于不伴有淋巴结转移者,并且差异均具有统计意义(P<0.05)。3.Nm23-h1蛋白主要表达于细胞质中,呈棕黄色颗粒状。Nm23-h1蛋白在CMM、皮肤交界痣及正常皮肤组中阳性表达率为15.15%(10/66)、44.67%(14/30)和80.00%(16/20)。Nm23-h1蛋白在CMM、皮肤交界痣及正常皮肤中表达逐渐增强,其在三组中的阳性表达率差异具有统计学意义(P<0.05),三组间两两比较显示:CMM组中Nm23-h1蛋白阳性表达明显低于其在皮肤交界痣中的阳性表达,其在交界痣的表达明显低于正常皮肤组织中的表达(P<0.05);在CMM中随肿瘤浸润深度的增加Nm23-h1蛋白的阳性表达也逐渐降低,在伴有淋巴结转移的CMM患者中Nm23-h1蛋白表达水平低于不伴有淋巴结转移者,并且差异均具有统计意义(P<0.05)。4.Tiam1及Nm23-h1蛋白表达的相关性分析:Tiam1蛋白的表达与Nm23-h1蛋白的表达均呈负相关(r=-0.298,P<0.05)。结论1.Tiam1在恶性黑色素瘤的发生、发展过程中存在促进作用。2.Nm23-h1在恶性黑色素瘤的发生、发展过程中起一定的抑制作用。3.Tiam1、Nm23-h1可能作为治疗恶性黑色素瘤的基因靶点,为恶黑的诊断治疗及预后分析提供新的参考。