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甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物之一,是我国最主要的食用植物油来源。在相同遗传背景下,与黑籽油菜相比,黄籽油菜的种子具有多方面的优势:种皮薄、含油量和蛋白质含量高、纤维素和多酚物质含量低、色素少、油质清澈透明等,因此选育高产优质的甘蓝型黄籽油菜是油菜育种中改良甘蓝型油菜品质的一条重要途径,油菜的黄籽性状也成为了油菜品质育种的研究热点。本研究以来源于甘蓝型黑籽油菜94570和人工合成甘蓝型黄籽油菜No.2127-17的褐籽和黄籽近等基因系为材料,对其种皮颜色基因D进行精细定位,并对褐籽和黄籽不同发育时期种皮的类黄酮含量和转录组进行比较分析,为进一步克隆油菜种皮颜色基因和阐述油菜黄籽形成的分子机制奠定了基础。本研究主要结果如下:1.甘蓝型油菜种皮颜色基因D的定位通过AFLP技术和白菜、甘蓝型油菜参考基因组序列信息开发标记,获得了一系列IP、SSR和SNP标记,将种皮颜色基因D定位在甘蓝型油菜A9连锁群上SSR标记H2SSR120和H2SSR237之间1.53c M的区间内,对应甘蓝型油菜‘Darmor-bzh’参考基因组A9染色体上约140kb的范围。通过全基因组重测序结合混合分组分析(BSA)的方法,获得1个种皮颜色基因D的候选区段,位于甘蓝型油菜A9染色体上27.65Mb-32.73Mb,与遗传连锁分析分析结果一致。通过开发Indel标记,获得19个多态性标记,覆盖约830kb大小的区段,进一步加密遗传连锁图,将目标基因定位在In Del标记Bn A9ID60-3和Bn A9ID161-1之间,2个标记在甘蓝型油菜A9染色体的距离约为105kb。2.甘蓝型黄籽和褐籽油菜种皮中原花青素含量存在显著差异对亲本和近等基因系发育过程中的种子及其胚、种皮进行原花青素及其前体物质黄烷醇的化学染色,结果表明甘蓝型油菜种子的原花青素主要在内种皮中积累,而且从开花后21天开始直至种子成熟时期,黄籽油菜的种皮中原花青素及其前体物质的含量都显著低于黑/褐籽。LC-ESI-MS/MS分析结果表明原花色素合成途径中一些关键的可溶性代谢物在黄籽种皮中的相对含量从开花后21天之后低于黑/褐籽。不溶性原花青素含量的比较分析也表明黄籽种皮不溶性原花青素含量远远低于黑/褐籽种皮。3.甘蓝型黄籽和褐籽油菜不同发育时期种皮的转录组比较分析通过对褐籽、黄籽近等基因系中5个不同发育时期种皮的转录组进行比较分析,发现了褐籽和黄籽之间在种皮的5个发育时期总共有4,974个差异表达基因,其中3,128个在黄籽种皮中上调表达,1,835个在黄籽种皮中下调表达。GO功能富集分析发现上调基因主要富集在各种与刺激响应相关的生物过程中,而下调基因主要富集在次生代谢过程,尤其是是苯丙烷和类黄酮代谢过程。KEGG富集分析结果表明181个上调表达基因显著富集在7个通路上,主要包括植物-病原菌互作、植物激素信号转导和内质网上的蛋白加工、脂肪酸延长等通路,这些通路主要与植物刺激响应相关。而下调基因显著富集在次生代谢物合成、苯丙烷合成、类黄酮合成、苯丙氨酸代谢等通路上。4.甘蓝型油菜种皮中类黄酮合成相关基因的表达差异是黄籽和褐籽种皮颜色差异的根本原因参与类黄酮合成途径的12个关键结构基因(PAL、C4H、4CL3、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、ANR、TT12、AHA10、TT19)和3个转录因子基因(TT1、TT8、TT16)在黄籽种皮中均下调表达,使黄籽种皮中原花青素合成受阻,是黄籽和褐籽种皮颜色的差异形成的主要原因。这些与原花青素合成相关的基因在甘蓝型油菜种皮发育过程中表现了相似的表达模式,表明这些基因可能共同受一个上游的调控因子调控。通过差异表达的转录因子基因的表达模式分析,鉴定出3个新的可能参与类黄酮合成的调控网络的转录因子基因,包括2个MYB-related基因(Bna A09g44970D、Bna A09g44370D)和1个b HLH基因(Bna A09g42390D)。5.种皮颜色基因D定位区间的候选基因的筛选通过共线性分析将种皮颜色基因D的定位区间锁定在甘蓝型油菜A9染色体105kb的区段和chr A09_random 339kb的区段上或者白菜基因组A9染色体的545kb的区段内。通过与拟南芥基因组进行BLASTP比对,进行基因注释,发现该区段内存在130个基因。结合黄籽、褐籽种皮转录组比较分析结果,在基因D的定位区段筛选出36个注释基因作为候选基因,其中包含一些可能参与类黄酮合成的转录因子基因和编码与转运相关的蛋白的基因。