目的:　　通过探讨随年龄增长小鼠胸腺内细胞增殖、凋亡的动态变化趋势，以及在此过程中Wnt4信号的变化，并研究增强Wnt4信号对体外培养的胸腺上皮细胞增殖和凋亡的影响，进而了解Wnt4信号在胸腺增龄性萎缩过程中的分子调节机制。为进一步认识胸腺与老化，提高老龄人口健康水平提供科学的理论依据。　　方法　　1、小鼠自然老化模型　　购买时1月龄C57BL/6小鼠，按照实验设计饲养到不同月龄，每组6～8只，雌雄各半。所有小鼠均在中国医科大学附属盛京医院实验研究中心动物部SPF级室饲养。　　2、分离纯化胸腺细胞和基质细胞　　(1)将胸腺组织在无菌PBS中漂洗几遍，然后用含胶原酶Ⅱ，胰酶和DNaseⅠ酶的消化液37℃消化30min。　　(2)细胞悬液首先与偶联有小鼠CD45抗体的磁珠(Miltenyi)进行孵育，然后经有磁性的LS柱吸附，最后用MACSbuffer洗脱。CD45为淋巴细胞特异性表达，因此阴性分选到的是胸腺基质细胞，而阳性吸附的则为胸腺细胞。　　3、检测不同年龄阶段TECs和各胸腺细胞亚群的增殖和凋亡水平　　(1)增殖水平的测定:C57BL/6小鼠腹腔注射Edu。24h后收集胸腺组织并制备单细胞悬液，然后进行磁珠分选。按照实验设计，胸腺细胞进行CD4和CD8抗体标记，胸腺基质细胞进行EpCAM1抗体标记。然后按照Edu检测试剂盒进行细胞增殖检测。　　(2)凋亡分析:首先使用磁珠分选法分离纯化TSCs和胸腺细胞，进行细胞表面抗体标记后按照细胞凋亡检测试剂盒说明进行AnnexinⅤ-FITC荧光标记，同时PI标记用于去除死细胞。　　4、检测不同年龄TSCs和胸腺细胞Wnt4信号相关基因表达水平　　分离不同年龄阶段TSCs和胸腺细胞后用TRIzol试剂提取出总RNA，然后反转录合成cDNA。进行实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitate realtime-PCR)，检测随年龄增长，TSCs和胸腺细胞中Wnt4、FoxN1、Bcl-xL基因表达水平的变化。　　5、检测外源Wnt4信号对MTEC1细胞增殖和凋亡的影响　　(1)凋亡影响:对照组（仅细胞培养液）;Dex实验组;Dex+Wnt4实验组。培养48h后，AnnexinⅤ法检测各组MTEC1细胞凋亡水平。　　(2)增殖影响:MTEC1细胞分别用LiCl刺激(24h)或外源重组Wnt4蛋白刺激(16h)，Edu法测细胞增殖变化。　　结果:　　1、随年龄增长，胸腺老化的表现以及Wnt4信号的变化　　随年龄增长，胸腺体积逐渐缩小;胸腺内各种细胞数量（包括胸腺总细胞数，TECs数，胸腺细胞总数以及CD4、CD8、DN、DP亚群细胞数）也随年龄增长而明显减少。同时随年龄增长，TSCs和胸腺细胞中Wnt4信号相关基因Wnt4、FoxN1和Bcl-xL表达量都有所下降。并且在胸腺中Wnt4蛋白主要是由TSCs所分泌的。　　2、随年龄增长，TECs和各胸腺细胞亚群增殖及凋亡水平的变化　　Edu检测结果表明随年龄增长，TECs和各胸腺细胞亚群的增殖水平持续下降。另外，细胞凋亡检测结果表明老年小鼠胸腺内各种细胞(包括TECs、CD4、CD8、DP、DN、ETP)的凋亡比例都明显增高。　　3、外源性Wnt4信号对MTEC1细胞增殖和凋亡的影响　　(1)相比较对照组，Dex作用下MTEC1细胞凋亡比例增加，而在同时添加Dex和外源Wnt4蛋白的培养液中，MTEC1细胞凋亡比例可维持在正常水平，说明外源性Wnt4信号能有效的减轻Dex对MTEC1细胞的凋亡诱导作用。　　(2)通过体外添加LiCl和外源Wnt4蛋白的方法激活Wnt4信号，流式分析结果显示MTEC1细胞增殖比例增加约10％。可见，激活Wnt4信号能够有效的促进MTEC1细胞的增殖。　　结论:　　在胸腺增龄性萎缩过程中，Wnt4信号的改变是引起细胞增殖和凋亡失衡的一个原因。Wnt4信号能有效的促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，而随年龄增长，胸腙内细胞分泌Wnt4蛋白能力下降，影响下游靶基因FoxN1和Bcl-xL的表达，引起胸腺上皮细胞和胸腺细胞的增殖能力下降，凋亡水平升高，胸腺微环境被破坏，孵育T细胞的能力下降，最终导致胸腺增龄性萎缩。