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葡萄(Vitis L.)是世界上种植最广泛且具有重要经济价值的果树,葡萄霜霉菌可以感染葡萄的叶片、花序和幼嫩组织,导致其产量和品质下降。效应蛋白是由病原菌分泌的小分子量蛋白,在病原菌侵染植物的过程中起重要作用。目前,关于葡萄霜霉菌效应因子及其与宿主间的相互作用机制报道较少。本课题组前期对陕西杨陵地区采集的一个葡萄霜霉菌菌株进行了基因组测序分析,预测到31个编码CRN蛋白的基因序列,在本氏烟草中瞬时表达克隆到的候选PvCRN基因,发现PvCRN11可以诱导本氏烟草叶片细胞死亡而PvCRN20可以抑制INF1诱导的本氏烟草叶片细胞死亡。本研究通过对PvCRN11和PvCRN20进行亚细胞定位分析、调控植物PCD试验及作用机制、瞬时转化烟草后对辣椒疫霉菌致病力影响分析等,探讨了不同PvCRNs对植物免疫应答的调节作用。 以接种葡萄霜霉菌的感病葡萄‘黑比诺’叶片的cDNA为模板,通过半定量分析PvCRN11的表达模式,发现PvCRN11受到葡萄霜霉菌诱导表达,并在侵染前期有明显上调。通过亚细胞定位实验发现PvCRN11定位在细胞膜和细胞核中,推测其发挥作用的场所可能在细胞膜和细胞核。在本氏烟叶片中瞬时转化PvCRN11后接种辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)游动孢子,其病斑直径显著低于对照GFP,因此,在本氏烟草中过表达PvCRN11可以抑制辣椒疫霉菌的侵染。在拟南芥中稳定转化后,对生长4周的T2代叶片也接种辣椒疫霉菌游动孢子。转基因株系的相对生物量、离子渗透率显著低于WT。表明PvCRN11在拟南芥中的过表达也可以抑制辣椒疫霉菌的侵染。进而表明PvCRN11可以增强拟南芥、烟草对辣椒疫霉菌的抗性。对SA途径标记基因PR1和PR2,JA/ET途径相关基因PDF1.2和COR1通过qRT-PCR分析其相对表达量,结果表明过表达PvCRN11可以上调SA途径相关基因、下调JA/ET途径相关基因来调控植物对辣椒疫霉菌的抗性。 同样,以接种葡萄霜霉菌的感病葡萄‘黑比诺’叶片的cDNA为模板,对葡萄霜霉菌效应因子PvCRN20进行表达量分析,发现PvCRN20在侵染早期已有表达,在72h表达量达到最高。PvCRN20在本氏烟中的瞬时转化可以抑制死亡诱导子INF1诱导的叶片细胞死亡,对已报道的INF1通路的相关基因NbEDS、NbSGT1、NbRAR1及NbHSP90进行表达量分析,发现PvCRN20可以抑制这几个基因的表达从而抑制INF1诱导的烟草叶片细胞死亡。本氏烟叶片中瞬时转化PvCRN20,48h之后接种辣椒疫霉游动孢子,发现过表达PvCRN20可以促进辣椒疫霉菌的侵染。通过亚细胞定位发现PvCRN20定位在细胞膜和细胞核中,推测为其可能在细胞膜和细胞核中发挥作用,为探究其发挥功能是否依赖于细胞核定位,在其C端加上一个核输出信号NES(NELALKLAGLDINK),以无核输出信号的nes(NELALKAAGADANK)作为对照,发现PvCRN20NES仍然可以抑制INF1诱导的烟草叶片细胞死亡,仍可促进辣椒疫霉菌的侵染,说明PvCRN20发挥功能不依赖于细胞核定位。瞬时转化PvCRN20后接种辣椒疫霉菌,借助DAB染色法检测辣椒疫霉菌侵染初期H2O2的积累水平,发现PvCRN20通过抑制H2O2的积累从而促进侵染。