目的：　　金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，除引起人类局部化脓感染之外，还能引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至全身感染，如败血症、脓毒症等。近年来由于抗生素的广泛应用，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）感染日益严峻，大部分MRSA产肠毒素B(SEB)，SEB被认为在所有肠毒素中是最具毒性的一种肠毒素，目前临床上尚无针对 SEB中毒和感染的有效疫苗和药物。枯草芽孢独特的抗逆性和免疫学特性，可作为口服疫苗的优良载体。本课题拟在枯草杆菌芽孢表面上融合表达 SEB蛋白，使用重组芽孢口服免疫小鼠，观察其免疫原性，为以SEB枯草芽孢口服疫苗的研究奠定基础。　　方法：　　SEB在大肠杆菌中的克隆表达、纯化　　根据GenBank中SEB的序列，设计特异性引物，以临床分离金葡菌的DNA为模板，PCR扩增SEB基因，PCR纯化产物和pET-28a(+)质粒经BamH I、XholI双酶切后进行连接，转化感受态大肠杆菌BL21，对质粒进行双酶切，PCR鉴定和基因测序验证。IPTG诱导表达重组蛋白，对表达的蛋白进行纯化。以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及免疫印迹法（Western Blot）验证重组蛋白的表达。　　SEB基因在枯草芽孢表面的融合表达　　以构建的 pET-28a(+)-SEB质粒为模板进行 PCR扩增，PCR纯化产物与pUS186-CotC质粒经Xbal I、Hind III双酶切后进行连接，转化枯草杆菌WB600,营养枯竭法使用DSM培养基诱导芽孢生成；用SDS-PAGE和Western Blot对重组芽孢进行验证。　　动物实验　　将18只小鼠分为三组，分别naive，口服CotC芽孢，口服CotC-SEB芽孢，在第0、1、2、16、17、18、28、32、33、34天用灌胃针口服免疫小鼠1×109芽孢，第51天颈椎脱臼法处死小鼠。分别在第-1、15、31、47、50天采集大便、血清。用ELISA方法检测大便IgA水平、血清中的IgG1、IgG2a水平。　　结果：　　SEB在大肠杆菌获得表达　　用煮沸法从临床分离菌获得PCR模板，PCR扩增SEB基因，大小为801bp；重组的pET-28a-SEB基因经双酶切鉴定可见目的片段，测序结果显示SEB起始于ATG，终止于TGA，编码266个氨基酸，预测SEB蛋白分子量为31556.6Da，等电点为8.65，GRAVY值为-0.655，推测该蛋白为碱性蛋白和亲水性蛋白，同源性比较结果为99.00％，经IPTG诱导后，SDS-PAGE和Western blot结果显示在相应分子量35kDa可见重组蛋白。大量诱导表达重组蛋白后，在0.25mol/L的KCL溶液中进行切胶纯化后SDS-PAGE结果示在35kDa可见明显条带。　　构建了重组SEB枯草芽孢　　以 pET-28a(+)-SEB载体为模板进行 PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出约801bp的 DNA片段，重组的pUS186-CotC-SEB经双酶切鉴定可见目的片段，使用 DSM培养基获得高产量的重组芽孢，产量约为1*1011个/L，重组芽孢经SDS-PAGE和Western blot验证，在相应分子量41kDa左右可见目的条带，与预期分子量相符。　　口服重组SEB枯草芽孢诱导小鼠体液免疫　　使用重组芽胞口服免疫小鼠2周后大便SEB特异性IgA水平明显升高，并在第47天达到最高峰，重组芽孢组与非重组芽孢处理组相比有显著性差异（P<0.001）；血清SEB特异性IgG1、IgG2a水平在第15天明显升高，其中IgG1水平在第47天达到最高峰，IgG2a在第51天达到最高峰，重组芽孢组与非重组芽孢处理组相比有显著性升高（P<0.05），血清 IgG2a水平升高明显，提示口服重组SEB芽孢诱导Th1优势免疫。　　结论：　　成功构建了SEB的原核表达系统、获得纯化的SEB蛋白，并构建表达SEB重组枯草芽孢，重组芽孢口服免疫小鼠后，可诱导大便SEB特异性IgA，血清特异性IgG1、IgG2a显著升高，说明重组芽孢具免疫原性，为其后续免疫保护研究奠定了基础。