论文部分内容阅读
目的：⑴探讨CysLT受体对缺氧缺糖损伤/恢复(OGDIR)后，星形胶质细胞水通道蛋白4( AQP4)表达及细胞损伤的调节作用，以及可能的信号通路。⑵制备新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体(pAb)，并鉴定其免疫学特性。
方法：①以MTT及LDH法，检测不同时间OGD后恢复24 h对原代培养大鼠星形胶质细胞活性的影响，确定合适的时间点制作OGD/恢复(OGD/R)诱导损伤的模型；②以RT-PCR及免疫组化法，检测该条件下大鼠星形胶质细胞CysLT1及CysLT2受体的表达情况；③以MTT及LDH法，检测CysLT受体拮抗剂对OGD/R引起原代培养星形胶质细胞损伤的作用，并以Western blot及免疫组化法，检测对AQP4表达的影响；④以AQP4 siRNA抑制AQP4表达，进一步确定AQP4在OGD/R损伤中的作用；⑤最后，以Westem blot法检测MAPK通路的激活，并观察MAPK抑制剂对OGD/R诱导的星形胶质细胞的损伤及其对AQP4表达的影响。⑥以KLH偶联的GPR17多肽免疫家兔制备其pAb，用间接ELISA法测定抗体效价，阻断ELISA测定抗体敏感性及特异性，同时以新制备的抗体做Westem blot，检测GPR17的组织表达。
结果：⑴原代培养大鼠星形胶质细胞随OGD时间的延长，损伤逐步加重，在OGD4h/恢复24 h(OGD4 h/R24 h)时细胞存活率在65％～70％左右，将此条件作为后续实验的损伤条件。正常培养条件下，星形胶质细胞有CysLT1受体的表达，而CysLT2受体表达很弱，OGD4 h/R24 h后，CysLT1受体的表达基本不变，而CysLT2受体表达明显增强。OGD4 h/R24 h诱导的星形胶质细胞的损伤，可被CysLT2受体选择性拮抗剂BaycysLT2(1μM)及受体非选择性拮抗剂Bayu9773(1μM)所拮抗，而不被CysLT1受体选择性拮抗剂孟鲁司特(1μM)所拮抗，证明CysLT2受体介导OGD4 h/R24 h诱导的星形胶质细胞损伤。同时OGD4 h/R24 h后AQP4的表达上调，并且这种作用同样可被CysLT2受体拮抗剂而非CysLT1受体拮抗剂所抑制。AQP4 siRNA抑制AQP4表达，并减轻OGD4 h/R24 h诱导的细胞损伤，进一步证明OGD过程中AQP4的表达增加，加重细胞损伤。同时，OGD4 h/R24 h损伤后ERKI/2、p38被激活，并且ERK1/2、p38的抑制剂能够拮抗OGD4 h/R24 h诱导的细胞损伤及AQP4上调。⑵通过免疫家兔获得的抗GPR17 pAb，ELISA测定显示其抗体效价最高可达到1/16364，并对CysLT1受体和CysLT2受体基本无交叉反应，具有较好的特异性。Westem blot结果显示，GPR17在大鼠脑和心脏组织中有较高的表达，其分子量在43 kD左右。
结论：①CysLT2受体介导OGD4h/R24 h诱导的星形胶质细胞损伤。②OGD4 h/R24 h后，CysLT2受体介导AQP4表达上调，这种上调加重OGD4 h/R24 h诱导的细胞损伤。③ERK1/2、p38 MAPK激活参与调节CysLT2受体介导的星形胶质细胞AQP4表达上调及OGD4 h/R24 h损伤。④制备的GPR17 pAb具有较高的效价和较好的特异性，能满足Westem blot检测GPR17的要求。