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目的:目前提取Buffy coat时普遍应用Ficoll离心法,但该法因Ficoll具有细胞毒性而不能应用于临床,本实验研发一种简便和安全的能用于临床的Buffy coat提取法。方法:选取20只健康新西兰白兔(16周龄,雄性,体重3.0～3.5kg)进行实验。使用含有2ml柠檬酸钠的注射器从兔子髂前上棘中提取4ml骨髓,将采集的骨髓放置含有Ficoll的试管中并离心为Ficoll组(F),和放置不含有Ficoll的试管中并离心为新方法组(N);将F组和N组用4℃ 2000rpm、离心力1000g的离心机离心30分钟。离心后F管中可见Ficoll和血清间有一个独特的上层血清,其下为Ficoll和血清间的浅黄色液体(Buffy Coat),底部是红血球;N管顶部血清和红细胞间见一层很薄的Buffy Coat模糊层,从血清下端和红细胞上端与Buffy Coat一起提取约1ml样品,将其置于lml注射器中进行第二次离心,时间减少到15分钟,离心后可见一个明显的上层血清,其下为深黄色液体(Buffy Coat)和底部的红细胞。高倍镜下计数F组和N组分离的Buffy Coat中间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)的数量。利用含有10%FBS和1%抗生素-抗真菌溶液的α-MEM的MSC培养基中培养MSC12天后形成成纤维细胞集落形成单位法(Colony forming unit-fibroblast,CFU-f)的数量。采用 ELISA法检测各组的转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1),血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF),成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF),胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1),内皮生长因子(Endothelial growth factor,EGF)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等生长因子和白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-lβ),白细胞介素(Interleukin—6,IL-6)及肿瘤坏死因子(Tissue necrosis factor-α,TNF-α)等细胞因子。结果:1.两组 MSC 计数比较无统计学差异(2766±345.75vs2757.25±344.66,P>0.05);2.N 组和 F 组的 TGF-β1 平均值各为 1.29ng/ml 和 1.28ng/ml;PDGF 各为 1.49ng/ml 和1.42ng/ml;FGF 各为 1.34ng/ml 和 1.33ng/ml,IGF-1 各为 240.94pg/ml 和 220.96pg/ml;EGF 各为 164.81pg/ml 和 161.91pg/ml,VEGF 各为 37.26pg/ml 和 35.42pg/ml,两组间上述各生长因子比较均无统计学差异(n=16,均P>0.05)。3.N组和 F组的 IL-1 平均值各为 866.55pg/ml和 870.78pg/ml;IL-6各为 218.64 和 259.78;TNF-α各为1073.29pg/ml和929.84pg/ml,两组间上述各细胞因子比较均无统计学差异(n=16,均P>0.05)。结论:1.采用新方法提取的骨髓源Buffy coat无细胞毒性,而MSCs数量、各种生长因子和炎症因子几乎与Ficoll离心法提取的Buffy coat相似。2.新方法可以替代旧的Ficoll法,本实验结果为临床应用骨髓Buffy Coat及在组织工程领域的研究提供了的实验依据。