在医药领域,抗菌药物的发现与使用是20世纪人类最伟大的成就之一,其后随着研究者们对抗菌药物的深入研究以及各种化学合成技术的发展,抗菌药物的种类也得到的快速的增加和变得多样化。如果说人类利用各种结构的抗菌药物对不同或相同种属的感染细菌进行杀灭或抑制作用是人类对感染病菌的第一次征服的话,那么由于抗生素的不合理使用而导致的细菌耐药性的事实将是人类目前所需面临得对病原菌的第二次征服之战。为了获得第二次“战争”的胜利,必须首先清楚地了解细菌对各种抗菌药物的耐药机制,针对各种耐药机制寻找新的药物作用靶标并研制开发出疗效更好的药物。在了解了细菌对抗生素的各种耐药机制后发现,几乎都有蛋白质的参与,如外排泵系统、细胞膜渗透性的变化、核糖体保护蛋白、药物灭活酶等,可见蛋白质在细菌的耐药中有着举足轻重的作用。目前研究最多的蛋白质是与细菌外膜渗透性变化相关的蛋白质。外膜结构是革兰阴性细菌所特有的结构,因此与革兰阳性菌相比,在其他耐药机制相似的前提下,还有外膜的屏障作用,使得革兰阴性菌比阳性菌更易耐受药物的作用。因此,对革兰阴性细菌外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)的研究也最多。大肠埃希氏菌作为临床常见的条件致病菌,也是典型的革兰阴性细菌,与其耐药机制中相关的外膜蛋白有OmpC,OmpF,PhoE,LamB和蛋白K。本实验选择大肠杆菌的外膜蛋白中的一种-外膜蛋白F(OmpF)进行进一步研究,以期为后续与之同源或结构相似的蛋白质在细菌耐药方面的研究奠定实验基础。　　 本研究首先利用NCBI数据库和Premier Primer5.0软件设计出合适的PCR引物,通过PCR技术,以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增大肠杆菌外膜蛋白F基因序列,用NcoI和XhoI对目的基因片段进行双酶切,经过纯化处理后的酶切产物,与pET-28c(+)载体进行连接,连接产物转化入克隆型大肠杆菌宿主细胞Top10,通过抗性筛选和酶切鉴定的方法筛选出阳性克隆。重组质粒的原核表达与鉴定将测序J下确的克隆转化入表达型大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3),利用IPTG诱导目的蛋白的表达,取不同时间的培养物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,确定出最优表达温度,再在此条件下大量表达目的蛋白,并利用金属离子亲和层析技术,由带有六聚组氨酸标签的融合蛋白与重金属镍离子特异性非共价结合而纯化出目的蛋白,同时对纯化后的目的蛋白进行质谱检测。成功构建了原核重组质粒pET-OmpF。经过测序表明,OmpF基因片段全长1089bp。SDS-PAGE结果发现,当大肠杆菌的诱导温度为25℃时,目的蛋白的表达率最高。利用金属离子亲和层析技术可纯化出符合质谱检测纯度要求的蛋白质,利用MALDI-TOF质谱对目的蛋白进行检测。本实验利用pET系列载体-pET-28c(+)载体通过分子生物学的方法,将目的蛋白基因插入其中,转入宿主细胞后成功构建并表达出了大肠杆菌外膜蛋白F,同时镍离子亲和层析柱对含有组氨酸标签的融合蛋白进行特异性地吸附分离纯化作用,为后续质谱的检测提供了纯度较高的蛋白样品。通过MALDI-TOF质谱检测,确定出OmpF的一级结构,为后续与之同源或结构相似的蛋白质在细菌耐药方面的研究奠定了实验基础。