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心血管疾病（cardiovascular diseases，CVDs）是全球范围内导致死亡人数最高的疾病。其中，脂质代谢障碍引起的动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是CVDs的主要诱因。AS的初始阶段与血管内皮损伤关系密切，氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）在血管内皮细胞炎症和脂质损伤中扮演了重要的角色。槲皮素是饮食中最丰富的抗氧化剂之一，具有抗脂质过氧化、抗炎等作用，能有效预防和干预AS。但是，槲皮素干预AS的分子机制尚未阐明。此外，槲皮素存在水溶性差、见光易分解、作用时间短等问题，限制了其在食品领域的应用。因此，本课题在前期研究基础上，构建了Ox-LDL损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）模型，从非编码RNA（ncNRA）角度分析了槲皮素减轻血管内皮损伤的作用靶点及信号通路，为阐明槲皮素干预AS的分子机制提供了新的理论依据；构建了Pickering乳液运载体系，并通过动物实验评价了载槲皮素乳液的心血管保护效果，为进一步开发相关功能食品提供了技术参考。
具体研究结果如下：
（1）槲皮素缓解Ox-LDL诱导HUVECs损伤细胞模型的建立。分别使用Ox-LDL（25～200μg/mL）和槲皮素（10～300μM）处理HUVECs，结果显示Ox-LDL降低HUVECs细胞存活率的IC50值为128.2μg/mL。结合实际情况，选择125μg/mL的Ox-LDL浓度作为后续实验的损伤浓度。此外，槲皮素在0～30μM浓度范围内对HUVECs细胞没有表现出毒性，选择5、10、15、20、25μM的浓度梯度用于后续实验。
（2）槲皮素对内皮脂质损伤的保护作用。槲皮素预处理可以缓解Ox-LDL诱导的HUVECs细胞损伤，降低细胞内活性氧（ROS）的产生和释放。进一步分析表明，槲皮素可以显著提高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量/酶活力，降低乳酸脱氢酶（LDH）活力，减少丙二醛（MDA）积累，有效恢复胞内氧化应激稳态。此外，槲皮素预处理还可以挽救Ox-LDL损伤导致的线粒体膜电位的丧失，进而减少细胞凋亡的发生。
（3）基于全转录组高通量测序的槲皮素干预Ox-LDL诱导HUVECs细胞损伤的分子机制。通过GO功能富集、KEGG通路富集以及分层聚类分析，明确PTEN/PI3K/AKT/Caspase9轴可能是槲皮素的潜在作用通路。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹法（Western-blot）验证，证明槲皮素可能通过PTEN/PI3K/AKT/Caspase9途径调控细胞抵御Ox-LDL损伤。结合转录组学及靶点预测分析（Tatgetscan7.1和Starbase2.0）结果，筛选出miR-494-3p以及MALAT1可能作为槲皮素上游作用靶点，通过内源竞争性（ceRNA）调控方式直接介导槲皮素对下游PTEN的调控作用。进一步通过qRT-PCR、Western-blot、抑制剂/过表达载体转染、双荧光素酶实验以及对表观作用效果（存活率、ROS、线粒体膜电位检测）的验证，我们证明了miR-494-3p和MALAT1可能是槲皮素的上游靶点并通过ceRNA调控方式发挥作用。槲皮素对内皮的保护效果可能是通过miR-494-3p/MALAT1/PTEN/PI3K/AKT/Caspase9轴实现的。
（4）玉米醇溶蛋白/山楂果胶复合胶体颗粒（ZHPs）的构建。研究分析了不同复合比例胶体颗粒在粒径、Zeta电位以及三相接触角等方面的差异，发现当复合比例为1∶1时颗粒呈现出近中性润湿性（θo/w=93°）。采用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）对ZHPs的微观结构进行观察，明确了果胶分子对玉米醇溶蛋白胶体颗粒（ZPs）的包裹状态。进一步结合傅里叶红外光谱（FTIR）和Zeta电位结果，证明复合颗粒中果胶大分子对ZPs的包裹状态是氢键和静电吸附作用的结果。所合成的复合比例为1∶1的ZHPs具有良好的两亲性，可用于Pickering乳液的制备。
（5）ZHPs稳定的Pickering乳液（ZHPEs）特性分析。通过乳液粒径、低场核磁（LF-NMR）和流变学等分析手段，研究了不同油相分数对ZHPEs性质的影响。结果表明，室温储藏1个月后，油相分数为0.1～0.4的ZHPEs有水相析出；油相分数为0.5～0.7的ZHPEs始终保持稳定；油相分数为0.6、0.7的ZHPEs在储藏1天后转化为半固体乳液凝胶。采用激光共聚焦显微镜（CLSM）和冷场扫描电镜（cryo-SEM）对ZHPEs界面结构进行观察。cryo-SEM结果显示，ZHPEs液滴表面密布球状颗粒属于Pickering型乳液，连续相中存在的复杂交互网络限制了液滴间的相对运动。CLSM也观察到液滴表面颗粒间的纠缠联结，这正是高油相分数ZHPEs呈现出胶体特征的原因。结果表明，通过改变ZHPEs的油相分数可以操控其流变学特性及界面结构，以满足不同情况对于乳液运载体系的多样化需求。
（6）山楂果胶对ZHPEs中油相脂质氧化的抑制作用。研究了山楂果胶的羟自由基清除能力和总抗氧化能力（T-AOC）及其对ZHPEs中MDA含量的影响。相比于商品果胶，山楂果胶表现出更强的羟自由基清除能力及总抗氧化能力，这主要归因于山楂果胶分子量较低，且纯化过程中部分小分子抗氧化活性成分（山楂源活性成分）残留/接枝在山楂果胶中。MDA结果显示，未乳化的玉米胚芽油中MDA含量为25.46±1.03μmol/kg，显著高于乳液中MDA含量。而相比于商品果胶制备的Pickering乳液（ZCPEs和ZAPEs），ZHPEs对其油相中MDA含量（8.32±0.70μmol/kg）具有明显的抑制作用表明山楂果胶自身所具有的抗氧化活性可以为乳液（油相）提供额外保护。
（7）动物实验评价槲皮素的体内抗胆固醇损伤效果及Pickering乳液运载体系的递送效果。研究对不同处理组小鼠血清抗氧化酶、血脂水平和肝功指标进行检测，同时牺牲小鼠利用H＆E或油红O染色等手段对其组织进行分析。结果表明，槲皮素直接给药可以显著减弱胆固醇损伤、恢复体内脂质代谢稳态，特别是可以缓解脂肪性肝损伤和主动脉血管脂质损伤。此外，相比于直接给药，通过ZHPEs递送给药相同剂量槲皮素呈现出更强的保护作用。这表明运载体系可以在不增加剂量的情况下提高槲皮素的体内作用效果。
具体研究结果如下：
（1）槲皮素缓解Ox-LDL诱导HUVECs损伤细胞模型的建立。分别使用Ox-LDL（25～200μg/mL）和槲皮素（10～300μM）处理HUVECs，结果显示Ox-LDL降低HUVECs细胞存活率的IC50值为128.2μg/mL。结合实际情况，选择125μg/mL的Ox-LDL浓度作为后续实验的损伤浓度。此外，槲皮素在0～30μM浓度范围内对HUVECs细胞没有表现出毒性，选择5、10、15、20、25μM的浓度梯度用于后续实验。
（2）槲皮素对内皮脂质损伤的保护作用。槲皮素预处理可以缓解Ox-LDL诱导的HUVECs细胞损伤，降低细胞内活性氧（ROS）的产生和释放。进一步分析表明，槲皮素可以显著提高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量/酶活力，降低乳酸脱氢酶（LDH）活力，减少丙二醛（MDA）积累，有效恢复胞内氧化应激稳态。此外，槲皮素预处理还可以挽救Ox-LDL损伤导致的线粒体膜电位的丧失，进而减少细胞凋亡的发生。
（3）基于全转录组高通量测序的槲皮素干预Ox-LDL诱导HUVECs细胞损伤的分子机制。通过GO功能富集、KEGG通路富集以及分层聚类分析，明确PTEN/PI3K/AKT/Caspase9轴可能是槲皮素的潜在作用通路。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹法（Western-blot）验证，证明槲皮素可能通过PTEN/PI3K/AKT/Caspase9途径调控细胞抵御Ox-LDL损伤。结合转录组学及靶点预测分析（Tatgetscan7.1和Starbase2.0）结果，筛选出miR-494-3p以及MALAT1可能作为槲皮素上游作用靶点，通过内源竞争性（ceRNA）调控方式直接介导槲皮素对下游PTEN的调控作用。进一步通过qRT-PCR、Western-blot、抑制剂/过表达载体转染、双荧光素酶实验以及对表观作用效果（存活率、ROS、线粒体膜电位检测）的验证，我们证明了miR-494-3p和MALAT1可能是槲皮素的上游靶点并通过ceRNA调控方式发挥作用。槲皮素对内皮的保护效果可能是通过miR-494-3p/MALAT1/PTEN/PI3K/AKT/Caspase9轴实现的。
（4）玉米醇溶蛋白/山楂果胶复合胶体颗粒（ZHPs）的构建。研究分析了不同复合比例胶体颗粒在粒径、Zeta电位以及三相接触角等方面的差异，发现当复合比例为1∶1时颗粒呈现出近中性润湿性（θo/w=93°）。采用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）对ZHPs的微观结构进行观察，明确了果胶分子对玉米醇溶蛋白胶体颗粒（ZPs）的包裹状态。进一步结合傅里叶红外光谱（FTIR）和Zeta电位结果，证明复合颗粒中果胶大分子对ZPs的包裹状态是氢键和静电吸附作用的结果。所合成的复合比例为1∶1的ZHPs具有良好的两亲性，可用于Pickering乳液的制备。
（5）ZHPs稳定的Pickering乳液（ZHPEs）特性分析。通过乳液粒径、低场核磁（LF-NMR）和流变学等分析手段，研究了不同油相分数对ZHPEs性质的影响。结果表明，室温储藏1个月后，油相分数为0.1～0.4的ZHPEs有水相析出；油相分数为0.5～0.7的ZHPEs始终保持稳定；油相分数为0.6、0.7的ZHPEs在储藏1天后转化为半固体乳液凝胶。采用激光共聚焦显微镜（CLSM）和冷场扫描电镜（cryo-SEM）对ZHPEs界面结构进行观察。cryo-SEM结果显示，ZHPEs液滴表面密布球状颗粒属于Pickering型乳液，连续相中存在的复杂交互网络限制了液滴间的相对运动。CLSM也观察到液滴表面颗粒间的纠缠联结，这正是高油相分数ZHPEs呈现出胶体特征的原因。结果表明，通过改变ZHPEs的油相分数可以操控其流变学特性及界面结构，以满足不同情况对于乳液运载体系的多样化需求。
（6）山楂果胶对ZHPEs中油相脂质氧化的抑制作用。研究了山楂果胶的羟自由基清除能力和总抗氧化能力（T-AOC）及其对ZHPEs中MDA含量的影响。相比于商品果胶，山楂果胶表现出更强的羟自由基清除能力及总抗氧化能力，这主要归因于山楂果胶分子量较低，且纯化过程中部分小分子抗氧化活性成分（山楂源活性成分）残留/接枝在山楂果胶中。MDA结果显示，未乳化的玉米胚芽油中MDA含量为25.46±1.03μmol/kg，显著高于乳液中MDA含量。而相比于商品果胶制备的Pickering乳液（ZCPEs和ZAPEs），ZHPEs对其油相中MDA含量（8.32±0.70μmol/kg）具有明显的抑制作用表明山楂果胶自身所具有的抗氧化活性可以为乳液（油相）提供额外保护。
（7）动物实验评价槲皮素的体内抗胆固醇损伤效果及Pickering乳液运载体系的递送效果。研究对不同处理组小鼠血清抗氧化酶、血脂水平和肝功指标进行检测，同时牺牲小鼠利用H＆E或油红O染色等手段对其组织进行分析。结果表明，槲皮素直接给药可以显著减弱胆固醇损伤、恢复体内脂质代谢稳态，特别是可以缓解脂肪性肝损伤和主动脉血管脂质损伤。此外，相比于直接给药，通过ZHPEs递送给药相同剂量槲皮素呈现出更强的保护作用。这表明运载体系可以在不增加剂量的情况下提高槲皮素的体内作用效果。