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目的:本研究旨在从细胞水平研究白藜芦醇(Resveratrol, Res)对D-半乳糖诱导的WI-38衰老细胞的保护机制,探讨MRG家族基因在Res抗衰老中的重要作用,为今后Res作为延缓衰老治疗提供理论和实验依据。
方法:(1)MEM(Minimum Essential Medium)培养人胚肺成纤维细胞(WI-38),PDL(population doubling level)27代进行实验。(2)建立衰老模型:D-半乳糖8g/l、16g/l、32g/l、64g/l分别对WI-38细胞干预24h、48h、72h、96h、120h, MTT法检测细胞增殖活力,绘制生长曲线。SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法检测细胞衰老程度。(3)研究分组:WI-38(PDL=27)细胞为对照组、16g/l的D-半乳糖诱导细胞衰老组,两种Res处理方式:衰老前Res预处理组、衰老后Res保护组。Res干预浓度为25μM、50μM、100μM、200μM、400μM,预处理干预时间2h,衰老后Res干预时间24h。MTT法检测各干预组细胞增殖活力及SA-β-Gal染色法检测细胞衰老程度,检测各组总SOD活性。用RT-PCR检测MORF4、MRG15、MRGX、PAM14的表达。SPSS16.0进行数据录入及统计学分析,ImageJ灰度值分析。
结果:WI-38细胞生长良好,对照组衰老染色可见蓝染细胞比例小于10%。D半乳糖8gll、16g/l、32g/l、64g/l、128g/l处理年轻WI-38细胞48h后,与对照相比各组细胞存活率呈现不同程度下降(P<0.05)。SA-β-Gal染色不同时间下D-半乳糖8g/l、16g/l、32g/l处理后细胞染色率均高于对照组(P<0.05)。100μM Res浓度下衰老细胞存活率最高,两种Res处理方式间无差别(P>0.05)。衰老后25μM、50μM Res保护组细胞存活率均高于同浓度衰老前预处理组(P<0.05)。25μM、50μM、100μM、200μMRes保护组染色率比衰老组分别降低了25.12%、33.02%、39.45%、32.31%,差异均有统计学意义(P<0.05)。100μM浓度的Res作用于衰老组细胞后,其总SOD活性不仅高于衰老组,而且也高于对照组(P<0.01)。衰老后Res各保护组总SOD活力均高于衰老组(P<0.01)。100μMRes能明显上调MORF4、MRG15基因的表达(P<0.05),400μM Res可下调MORF4、MRG15基因的表达(P<0.05)。
结论:1. D-半乳糖可诱导体外培养的WI-38细胞发生衰老改变,包括SA-p-Gal染色阳性率上升,细胞增殖能力降低。2.100μM Res浓度对衰老WI-38细胞保护作用最强,衰老后Res处理24h方式保护能力大于衰老前Res预处理2h方式。100μM Res浓度提高衰老WI-38细胞总SOD活性能力最强。3.100μM Res能明显上调衰老细胞MORF4、MRG15基因的表达,而400μMRes处理衰老细胞后,MORF4、MRG15基因的表达下调。