胃癌(gastric cancer，GC)是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一，在肿瘤类疾病的死亡率中排名仅次于肝癌、肺癌，高居第三位，是危害全世界人民生命健康的重大疾病。已有相关研究表明，能够促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、转移及成瘤，作为多种肿瘤的促癌基因，CD44也可能是胃癌的一个促癌基因。本实验主要应用RT-NestedP CR检测胃癌组织与癌旁正常粘膜中CD44转录子的表达情况，并将表达的CD44转录子与质粒连接、克隆、送测序鉴定，分析CD44剪接变异体与胃癌临床病理特征的关系，探讨其在胃癌发生、发展进程中所起的作用及影响，为胃癌的靶向治疗提供实验依据。　　目的:观察CD44剪接变异体在胃癌组织与癌旁正常胃粘膜中的表达情况;观察CD44各个剪接变异体在40例胃癌组织与癌旁正常胃粘膜中的表达情况，分析在胃癌中各个阳性表达的剪接变异体与临床病理特征的关系，并探讨其在胃癌发生、发展进程中所起的作用及影响。　　方法:收取3例临床手术切除的同等分化程度的进展期胃癌新鲜组织标本及相应癌旁正常胃粘膜;通过NCBI检索获得CD44基因包含全长CDS的mRNA序列，设计两对扩增引物进行RT-NPCR，选择内参扩增条带最好的病例进行CD44的RT-NPCR，扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定，采用DNA纯化回收试剂盒切胶纯化回收所有的目的扩增条带，并分别将所得的目的扩增条带（即RT-NPCR扩增的CD44转录子）与克隆载体(pMD18-T Vector)连接，并转入至感受态大肠杆菌(E.coli DH5α)中、平板培养、挑取阳性克隆菌落并进行扩增，送菌液抽提质粒，测序鉴定，应用DNAman软件对测序所得的DNA碱基序列拼接、应用BioEdit软件比对序列，并分析;将第一部分鉴定好的CD44转录子的扩增条带作为后续实验中胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织RT-NPCR CD44剪接变异体扩增条带的DNA Marker;对收取的40例新鲜胃癌组织标本和相应的癌旁正常胃粘膜分别取适量组织依次进行抽提总RNA、逆转录、巢式PCR扩增，结合DL5000DNA Marker与获得的CD44剪接变异体扩增条带的DNA Marker进行对比鉴定，观察所有标本中CD44各个剪接变异体的表达情况，并分别对阳性表达的CD44剪接变异体在胃癌组织及癌旁正常胃粘膜之间的表达情况与临床病理特征关系进行分析。　　结果:1、提取的3例进展期胃癌组织及癌旁正常胃粘膜的总RNAOD260/OD280值介于1.8-2.0之间，提示提取的总RNA中不含蛋白质或其他杂物，纯度较高。RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果显示RNA片段完整，28S，18S，5S三条带较为清晰，无拖尾，且28S∶18S＞2∶1。　　2、以GAPDH引物的RT-PCR产物作为内参照，3例胃癌标本胃癌组织与癌旁正常胃粘膜的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示均在411bp处有清晰明亮的扩增条带，但以第3例胃癌标本的CD44扩增条带较清晰明亮,无拖尾及其他明显杂带。　　3、以第3例胃癌标本提取的总RNA为模板RNA，进行CD44的RT-NPCR，对扩增产物进行琼脂糖电泳检测，结果显示胃癌组织有4条不同的大小的扩增条带，按次序大小分别约为2000bp，1500bp，1200bp和700bp，分别记为1，2，3，4号转录子，远癌组织胃粘膜中只见1条大小约为680bp的扩增条带，记为5号转录子，无其他明显杂带。　　4、测序结果分析:1号转录子与CD44v4同源性为99.66％，有3处碱基发生变化，即917G→A、924-→C、941A→C;2号转录子与CD44v2同源性为100％;3号转录子与CD44v3同源性为99.66％，有3处碱基发生变化，即1263C→G、1362G→C、1561G→T;4号转录子与CD44v8同源性为99.44％，有3处碱基发生突变，即651C→T、658C→G、807G→C;5号转录子与CD44v7同源性为98.87％，有5处碱基发生突变，即460C→T、497A→C、510C→G、690A→G、700A→T;经SnapGene查证变化的碱基对其编码蛋白的表达无明显影响，由此可以证实1号转录子就是CD44v4，2号转录子就是CD44v2，3号转录子就是CD44v3，4号转录子就是CD44v8，5号转录子就是CD44v7。　　5、40例标本胃癌组织中CD44v4的阳性表达率为47.5％(19/40)，CD44v2的阳性表达率为25.0％(10/40)，CD44v3的阳性表达率为55.0％(22/40)，CD44v8的阳性表达率为57.5％(23/40)，所有标本癌旁正常胃粘膜中CD44v7的阳性表达率为52.5％(21/40);所有标本癌组织与癌旁正常胃粘膜中未明显见到其他扩增条带表达。　　6、CD44各个剪接变异体与临床病理特征的关系:CD44v4的表达与淋巴结转移(x2=7.278，P=0.007)、分化程度(x2=11.235，P=0.001)、浸润深度(x2=9.048，P=0.003)、TNM分期(x2=14.593，P=0.000)有关，差异有统计学意义(P＜0.05);与性别(x2=0.067，P=0.796)、年龄(=0.000，P=0.987)、肿瘤大小(x2=2.434，P0.119)、Lauren分型(x2=1.520，P=0.218)无关，差异无统计学意义(P＞0.05)。CD44v2的表达与肿瘤大小(x2=11.868，P=0.001)、淋巴结转移(x2=8.000，P=0.005)、分化程度(x2=8.000，P=0.005)、TNM分期(x2=7.519，P=0.006)有关，差异有统计学意义(P＜0.05);与性别(x2=0.000，P=0.640)、年龄(x2=1.637，P=0.501)、Lauren分型(x2=1.671，P=0.196)、浸润深度(x2=3.333，P=0.068)无关，差异无统计学意义(P＞0.05)。CD44v3的表达与肿瘤大小(x2=4.835，P=0.028)、Lauren分型(x2=5.507，P=0.019)、淋巴结转移(x2=22.653，P=0.000)、浸润深度(x2=7.298，P=0.007)、TNM分期(x2=22.922，P=0.000)有关，差异有统计学意义(P＜0.05);与性别(x2=0.269，P=0.604)、年龄(x2=0.123，P=0.726)、分化程度(x2=0.637，P=0.412)无关，差异无统计学意义(P＞0.05)。CD44v8的表达与肿瘤大小(x2=3.913，P=0.048)、淋巴结转移(x2=32.471，P=0.000)、TNM分期(x2=25.765，P=0.000)有关，差异有统计学意义(P＜0.05);与性别(x2=0.017，P=0.896)、年龄(x2=0.474，P=0.491)、Lauren分型(x2=0.251，P=0.616)、分化程度(x2=1.153，P=0.283)、浸润深度(x2=1.637，P=0.201)无关，差异无统计学意义（P＞0.05）。CD44v7的表达与肿瘤大小(x2=8.338，P=0.004)、淋巴结转移(x2=16.047，P=0.000)、TNM分期(x2=14.593，P=0.000)有关，差异有统计学意义(P＜0.05);与性别(x2=0.067，P=0.796)、年龄(x2=0.000，P=0.987)、Lauren分型(x2=0.351，P=0.554)、分化程度(x2=1.931，P=0.165)、浸润深度(x2=2.030，P=0.152)无关，差异无统计学意义(P＞0.05)。　　结论:1、在胃癌中可能有CD44v2、CD44v3、CD44v4、CD44v8以及CCD44v7这5个CD44剪接变异体表达。　　2、CD44v2、CD44v3、CD44v4、CD44v8以及CCD44v7这5个CD44剪接变异体可能与胃癌的发生发展有关。