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耐药结核分枝杆菌,尤其是耐多药结核分枝杆菌的出现给结核病的检测和治疗带来了巨大的挑战,对人类健康产生了极大威胁。目前临床上常用的结核病的检测方法分别存在操作繁琐、仪器昂贵、耗时较长及易污染等不足。电化学DNA传感器是近几年发展起来的一种新型生物传感器,因其简单、灵敏、特异性强、易微型化等特点受到研究者的青睐,已被应用于多个领域的研究。然而电化学DNA传感器易受其他因素的干扰造成结果不稳定。实验前期构建的BSA单分子层控制组装界面为基础的电化学DNA传感器,有效地提高了体系的稳定性。本文在前期研究基础上,构建了一种新型检测体系,即用于耐多药结核分枝杆菌耐药基因检测的双通道电化学DNA传感器,同时对其特异性、灵敏性等性能进行了研究。此外,将新型生物传感器用于结核分枝杆菌标本耐药性的检测,结果表明,生物传感器能够有效避免其他杂质的影响,实现结核分枝杆菌耐药性检测。 (一)以BSA单分子层控制组装界面为基础,构建双通道电化学DNA传感器,用于耐多药结核分枝杆菌耐药基因的快速检测。在组装界面分别组装两套不同的探针序列,识别不同的目标分子,信号探针标记生物素或链霉亲和素,通过生物素-链霉亲和素的相互作用在电极表面组装酶分子,安培法检测酶催化相关氧化还原反应,能够实现不同目标序列的同时检测。对双通道DNA传感器性能研究,表明该双通道DNA传感器具有较好的特异性和灵敏性,能够区分单碱基错配序列,对rpoB,katG,inhA三种耐药基因的检测限分别为4.33×10-12mol/L,3.28×10-12mol/L,4.02×10-12mol/L。该双通道生物传感器不仅具有操作简单、低花费、灵敏度高、稳定性好、易微型化等特点,还能有效缩短检测时间,为结核病的诊治提供快速有效的依据。 (二)新型电化学DNA传感器用于耐多药结核分枝杆菌临床标本的检测。设计相应的引物扩增包含常见耐药基因突变位点的相应基因序列,新型电化学DNA传感器检测体系检测PCR扩增产物。由于PCR扩增产物处于双螺旋状态,在进行电化学检测时,杂交反应之前要进行变性过程,产生单链状态的目标序列。加入过量的信号探针,竞争性地与变性之后形成的单链目标序列杂交。对PCR扩增产物的检测结果表明文中构建的电化学DNA传感器能够有效避免PCR产物中杂质的影响,可与目标DNA分子结合,特异性较好,能够区分野生型标本和突变型标本。