世界范围内,尤其我国部分地区大气污染严重,为水体和大气中滋生的细菌提供了很好的温床,对人类健康造成了巨大的威胁。其中,军团菌多次被检测出存在于冷却塔及公共场所的空调系统、水系统中,而沙门氏菌则会通过动物粪便或动物尸体污染江河湖海等自然水源,是严重影响人类生命安全的两种致病菌。噬肺军团菌引起的军团菌肺炎症状不明显,易被误诊漏诊,而它的传播方式导致其极易流行,且病死率较高。近几年,军团病发病率在世界范围内呈增长态势,在我国也有越来越多的省份和地区出现军团菌病例发生的报告,及时、准确地发现诊断军团菌成了我们预防和诊治军团病的重要前提,本课题建立的噬肺军团菌重组酶聚合酶扩增快速检测方法(RPA)为此提供了更多的可能性。如今,由于各种食源性微生物的抗药性、适应性增强,致病菌导致的食物中毒案例依然屡见不鲜,是国内外卫生安全组织长期关注的重要课题。而沙门氏菌在世界各地的食物中毒病例中,都占到了绝对压倒于其他菌种的比例,是食品安全检测的一大关键目标。人们误食被沙门氏菌污染的水源或食物很容易引起感染,因此对于沙门氏菌快速检测技术手段的不断探究与开发对世界性的食品安全都有重大意义。本课题针对噬肺军团菌mip基因(GenBank登录号:AE017354)和沙门氏菌fimY基因(GenBank登录号:JQ665438.1)的相关序列,构建标准质粒,设计相关序列的RPA引物,通过平行试验,对设计的几组引物进行筛选。确定引物后,对RPA反应体系进行优化,包括反应时间的预估、反应温度的优化、Mg离子浓度的优化,优化后的体系如下:Buffer(含dNTPs)12.5μLLEG SIGMA FP 1 μL、LEG SIGMA RP 1 μL、Template 1 μL、Enzyme 5 μL、280 mM MgAC 1.25μL、SDw3.25μL,反应温度37℃,反应时长20 min。通过特异性实验比对,两组RPA引物和体系具有较强的特异性,专有检测对应菌种,未发现与其他致病微生物发生交叉反应的现象。在检测中两组引物的灵敏度极佳,噬肺军团菌的检出限为1.6×102CFU/mL,沙门氏菌的检出限为1.29×101-1.29×102CFU/mL,且与qPCR结果一致。分别在杭州市不同地区,采样搜集自然水、公共用水、空调排水等水样,利用RPA-LFD、qPCR法和传统培养法(参照化工行业标准HG/T 4323-2012;沙门氏菌参照国家标准GB 47894-2016)进行检测,作为对比可得知所有的水样中均未检测出沙门氏菌和噬肺军团菌。本研究结合重组酶聚合酶介导等温扩增技术RPA和侧向流动免疫技术LFD,分别建立了噬肺军团菌和沙门氏菌两种致病有害菌的RPA快速检测方法。在特异性高、灵敏度高、方便快捷、对设备技术要求低的RPA技术基础上,利用侧向流动技术LFD,结合于可用肉眼直接观察的试纸条,将RPA的检测结果快速直观地展现出来,为检测扩增产物提供了高效直接的新方法,开启了更加直接、快速、简便检测致病菌的新篇章。该技术手段,为检测有害致病菌的检测展开了新局面,特别是为偏远贫困地区的检测部门提供了新的可能性和工作思路。