一、研究背景骨质疏松症(Osteoporosis,OS)是一种以骨代谢异常为特征的系统性骨病,代谢异常导致骨的再生能力下降,进而产生延迟愈合、骨不连,甚至引起骨缺损。在骨质疏松症的诊疗方面,全球范围内投入的医疗费用及社会资源非常可观,而且伴随着世界人口老龄化的步伐,这种投入还在继续攀升。骨质疏松症合并骨缺损更是困扰临床工作的难题之一。虽然国内外的专家学者们已经开发出多种类型的组织工程支架,但是目前尚未找到一种理想的支架。理想的组织工程支架应该达到以下要求:支架应具有促进细胞粘附和增殖的能力;支架的降解产物不产生炎症或毒性;支架应能提供合适的机械支撑,以避免细胞被破坏性的压缩和拉伸;支架应能促进细胞成骨分化,以增强骨的再生能力。目前研究较为广泛的组织工程材料包括:天然生物材料:胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸等;人工合成高分子材料:聚乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚羟基乙酸;陶瓷材料:羟基磷灰石、磷酸三钙、生物玻璃;金属材料:不锈钢、钛、钽等。壳聚糖是一种碱性氨基多糖,由甲壳素脱乙酰化制备而成,其结构和性质类似氨基多糖,而氨基多糖正是细胞外基质中的主要成分。壳聚糖的生物相容性良好,而且降解产物无毒性作用,但是作为组织工程支架材料,壳聚糖的缺点在于其力学性能和成骨能力的不足。力学性能不足导致其无法为承重部位提供有效的机械支撑,成骨能力不足使其难以应用于骨质疏松性骨缺损的修复。为了解决这一问题,许多学者进行了制备复合材料的尝试。Bayer等制备了磷酸钙与壳聚糖组成的聚合物,形成类似骨组织的结构,可以通过调整材料的成分比例改变其部分性能,然而这种支架的弹性模量较低,力学支撑不足,而且对于这种支架材料的成骨能力也未做进一步研究。因此,与壳聚糖组成聚合物的材料,应该具有更高的弹性模量,以及更好的成骨能力。钽具有更高的弹性模量,同时具有较强的成骨能力,而且生物相容性良好,然而,钽材料由于比重大、过于致密等缺点,无法直接植入人体中。因此,我们对壳聚糖支架进行改良,制备成含钽壳聚糖复合支架。钽材料较高的弹性模量、较强的成骨能力能否弥补壳聚糖材料在力学性能与成骨能力方面的不足?复合支架能否达到修复骨质疏松性骨缺损所需的机械支撑和成骨能力?本研究将对含钽壳聚糖复合支架的力学性能、生物学特性以及动物体内骨质疏松性骨缺损的修复能力进行分析探讨。二、研究目的1.对含钽壳聚糖复合支架的力学性能进行检测。2.对含钽壳聚糖复合支架影响骨髓间充质干细胞的粘附、增殖及成骨分化的能力进行检测,以评估支架的生物学特性。3.利用骨质疏松兔模型检测含钽壳聚糖复合支架修复动物体内骨质疏松性骨缺损的能力。三、研究方法1.为研究含钽壳聚糖复合支架的力学性能,使用ElectroForce 3100 Test Instrument测出支架的载荷——位移曲线。对曲线初始阶段相对平滑的线性部分进行分析,并计算出支架的弹性模量(E)。2.为研究含钽壳聚糖复合支架的生物学特性,将大鼠BMSCs置于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中,置于培养箱中培养。隔天更换培养液,汇合后用0.25%胰酶消化,再用含血清的培养基中止消化,并制备细胞悬液。3.为研究含钽壳聚糖复合支架对大鼠BMSCs粘附的影响,培养的大鼠BMSCs分别接种至壳聚糖支架和含钽壳聚糖复合支架上。在1小时、2小时、4小时、8小时每个时间点,分别使用CCK-8法于450nm波长处测量OD值,间接反映支架对细胞粘附的影响。4.为研究含钽壳聚糖复合支架对大鼠BMSCs增殖的影响,将培养的大鼠BMSCs分别接种至壳聚糖支架和含钽壳聚糖复合支架上,使用CCK-8法在24小时、48小时、72小时、96小时和120小时每个时间点对450nm波长处的OD值进行测量。5.为研究含钽壳聚糖复合支架对大鼠BMSCs成骨分化的影响,培养的大鼠BMSCs分别接种至壳聚糖支架和含钽壳聚糖复合支架上,用成骨诱导培养基进行诱导培养。在成骨诱导后第7、14天进行ALP染色,第21、28天进行茜素红染色,以评估细胞的矿化程度。成骨诱导后第7、14、21、28天分别对样本矿化时所吸收的钙离子浓度进行定量分析,间接反映支架对成骨分化的影响。成骨诱导第28天后,Real-time PCR测定成骨相关基因表达,Western blot法测定成骨相关目标蛋白质表达。6.为研究含钽壳聚糖复合支架对骨质疏松性骨缺损的修复能力,将骨质疏松兔随机分为2组,在腰椎椎体制造骨缺损,然后分别将壳聚糖支架和含钽壳聚糖复合支架植入骨缺损部位。12周后取出椎体,使用Micro-CT对标本进行扫描,并对支架周围的骨小梁数量、骨体积分数、骨密度、骨小梁厚度进行检测及统计分析。用1%甲苯胺蓝对标本的硬组织切片进行染色后,镜下观察,并对骨面积分数进行检测及统计分析。四、研究结果1.复合支架力学性能测试结果复合支架力学性能良好。复合支架的弹性模量为3.07±0.12 GPa,壳聚糖支架的弹性模量为2.38±0.69GPa,复合支架的弹性模量高于壳聚糖支架,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。2.复合支架对骨髓间充质干细胞粘附的影响复合支架对骨髓间充质干细胞的粘附具有更好的促进作用。在第1小时、2小时、4小时、8小时每个时间点,细胞在复合支架表面的粘附能力均高于壳聚糖支架,并且差异逐渐增大。3.复合支架对骨髓间充质干细胞增殖的影响复合支架对骨髓间充质干细胞的增殖具有更好的促进作用。在第24小时、48小时、72小时、96小时、120小时每个时间点,细胞在复合支架表面的增殖能力均高于壳聚糖支架,并且差异逐渐增大。4.复合支架对骨髓间充质干细胞分化的影响复合支架对骨髓间充质干细胞的成骨分化具有更好的促进作用。含钽壳聚糖复合支架表面细胞的碱性磷酸酶阳性水平、钙结节颗粒数量明显高于壳聚糖支架,从更换成骨诱导分化培养基的第7天开始,复合支架表面细胞的钙离子吸收浓度均大于壳聚糖支架,并且差异逐渐增大。成骨诱导第28天后,Real-time PCR测定复合支架表面细胞的成骨相关基因表达高于壳聚糖支架,Western blot法测定复合支架表面细胞的成骨相关目标蛋白质表达高于壳聚糖支架3-5倍。5.复合支架修复骨质疏松动物模型骨缺损的能力复合支架对骨质疏松动物模型骨缺损具有更好的修复作用。Micro-CT显示复合支架周围的骨小梁厚度、骨体积分数、骨密度、骨小梁数量均高于壳聚糖支架,硬组织切片可见复合支架周围的骨面积比高于壳聚糖支架。五、结论我们的研究结果表明,含钽壳聚糖复合支架不但具有良好的力学性能,而且还能促进支架表面细胞的粘附、增殖及成骨分化,同时能够促进骨质疏松动物模型骨缺损的修复。含钽壳聚糖复合支架有望成为一种具有良好应用前景的骨修复材料。