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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染家猪引起的出血性、高致死性疾病。截止至2022年3月,非洲、欧洲、亚洲、美洲和大洋洲5个世界区域至少70个国家存在ASF疫情。ASFV病毒粒子结构复杂,基因组庞大。复杂的病毒结构和免疫逃避机制导致目前疫苗研究受阻。ASFV在流行过程中出现不同程度的变异,形成不同基因型、血清型和不同毒力的病毒株。ASFV遗传变异多发生于左、右MGFs数量和序列的变化,如OURT88/3、NH/P68、Estonia/WB/2014和BA71V株等基因组均发生MGFs变化。此外,NH/P68株和Lv17/WB/Rie1株的EP153R和EP402R（CD2v）基因均出现移码,国内分离的变异毒株多出现EP402R基因（CD2v）突变,如China/GD/2019株、Hu B20株、HLJ/HRB1/20和He B/Q3/20株,均无红细胞吸附能力,毒力出现不同程度降低。此外,国内也分离到与NH/P68高度相似的ASFV I型He N/ZZ-P1/21和SD/DY-I/21毒株。变异毒株流行是目前我国ASF防控面临的最大问题和挑战之一。灭活疫苗、自然减毒株疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗和病毒载体疫苗等类型的ASF疫苗研究不断被尝试。目前,基因缺失疫苗已获得突破性研究进展,联合缺失如9GL/UK、MGF505/360/CD2v、L7L-L11L等多个基因或B119L（9GL）、I177L和A137R等单个基因,可完全致弱ASFV毒力并能够抵抗亲本毒株致死剂量的攻击。ASFV编码超过150个基因,而目前超过半数的基因功能未知,有待研究。本研究的目的在于,一是通过对国内多地区猪肉样品中ASFV检测,了解ASFV流行情况和基因组变异特点;二是筛选新的ASFV毒力基因,构建基因缺失毒株,获得具有安全性和免疫效力的ASFV基因缺失疫苗候选株。研究方法和结果1.ASFV分离和分析本实验室在2018～2020年期间,在国内8个省市地区共收集猪肉、肋骨、肺、肝等组织样品2914份,通过q PCR方法检测出97份ASFV阳性组织,在单核巨噬细胞上分离得到36株ASFV,对常见变异基因p72、MGF505/360和CD2v进行PCR扩增和测序,获得了2株无血吸附特性的自然变异株Hu B20、LYG18毒株。该毒株的多处基因出现变异,表现不同的生长特性和毒力。2.ASFV I226R基因特征通过对NCBI数据库中11个基因型的26株ASFV I226R核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析,发现I226R基因在不同ASFV毒株中具有较高保守性。亚细胞定位分析发现,p I226R蛋白与p54蛋白一样定位于病毒工厂。通过q PCR检测ASFV的CP204L、B646L、I226R m RNA在不同感染时间的相对表达水平,结合ASFV基因的表达特点,判定p I226R主要表达于ASFV感染的中、晚期阶段。通过同源重组的方法构建了缺失I226R基因的SY18ΔI226R株,该毒株可在体外正常感染复制,I226R为ASFV复制非必需基因。3.SY18ΔI226R安全性试验使用高剂量(107.0TCID50)SY18ΔI226R肌肉注射感染仔猪,观察35天。仔猪存活率100%,均未出现发热、沉郁等异常临床症状,也未引起组织形态和病理损伤。免疫仔猪出现全身性感染,选择高拷贝病毒载量的组织研磨后进行体外的病毒分离和动物体内感染,发现组织中SY18ΔI226降低或丧失了在体内和体外感染的能力。结果表明,I226R是ASFV重要的毒力相关基因,SY18ΔI226R完全丧失毒力,具有良好的安全性。4.SY18ΔI226R株攻毒保护效力试验使用单剂量(103.5、104.5、105.5和106.5TCID50)SY18ΔI226R肌肉注射免疫仔猪,21天后攻击致死剂量(102.5TCID50)的亲本毒株。结果显示,免疫的仔猪存活率100%,均未出现发热、沉郁等异常临床症状,可高效诱导机体免疫应答和炎症反应。攻击强毒后,104.5TCID50≤单剂量免疫≤105.5TCID50仔猪实现部分保护,存活率为100%,单剂量免疫≥105.5TCID50仔猪实现完全保护,存活率为100%。结果表明SY18ΔI226R是一株具有良好保护效力的ASFV单基因缺失疫苗候选株。5.SY18ΔI226R/CD2v株构建和攻毒保护试验通过同源重组方法在SY18ΔI226R株基础上进一步缺失CD2v基因,构建了SY18ΔI226R/CD2v株,使用106.5TCID50剂量肌肉注射免疫仔猪,21天后肌肉注射攻击SY18株(102.5TCID50)。结果发现,感染SY18ΔI226R/CD2v株的仔猪无病毒血症,但攻击强毒后,所有仔猪出现持续5天左右的发热。结果表明,CD2v基因的缺失降低了SY18ΔI226R株的免疫原性。结论1.本实验室分离的两株ASFV自然变异株LYG18株和Hu B20株,分别是国内最早变异的ASFV株和国内发现的首个自然弱毒株。二者均在基因组序列、红细胞吸附性、毒力和复制能力上发生明显变化。2.I226R基因在ASFV中具有较高保守性,转录于感染的中、晚期,表达产物定位于病毒工厂,为ASFV复制非关键基因。3.首次构建了缺失I226R单基因的SY18ΔI226R重组毒。SY18ΔI226R诱导机体产生有效的免疫应答和炎症反应,该毒株高剂量(107.0TCID50)免疫不会引起机体损伤、单次免疫(≥105.5TCID50)可达到完全保护。SY18ΔI226R缺失株为国内首个缺失单基因即具有良好安全性和免疫效力的ASFV疫苗候选株。4.SY18ΔI226R/CD2v株免疫的动物在减低病毒血症的同时,也降低了免疫保护效力。