暗紫贝母(Fritillaria.unibracteataHsiaoetK.C.Hsia)是百合科(Liliaceae)贝母属(Fritillaria)植物川贝母的主要基源植物之一,其干燥鳞茎作为著名的中藏药材,具有悠久的药用历史。该药用植物主要分布在青海南部、四川西北部及甘肃南部海拔2800～4400 m的高寒草甸、高寒灌丛草地,生物碱是该属植物专属性较强的有效成分,其中以贝母素甲、贝母素乙、贝母辛为代表的异甾体类生物碱活性成分,除在治疗肺热燥咳,干咳少痰,阴虚劳嗽及咳痰带血等疾病具有显著功效外,还在心血管系统、中枢神经系统、抗菌、抗肿瘤等方面也具有重要的药理作用和应用前景。对暗紫贝母总生物碱的提取工艺优化,化学成分的分离纯化,药理研究及其对单体生物碱的快速、灵敏度高的分析测定方法的探索研究,依然是目前天然药物化学家们研究的热点,同时这些研究可为贝母类药材的质量控制,贝母生物碱高效分离,单体生物碱的获取,以及靶点药物的筛选和利用提供一定的科学理论依据。本论文以产自青海果洛地区的暗紫贝母为研究对象,对其进行了响应面优化微波-超声波协同萃取暗紫贝母总生物碱的提取工艺研究,对其化学成分进行了研究,然后利用分离得到的单体生物碱设计合成出暗紫贝母活性组分贝母素甲、贝母素乙、贝母辛的新型分子印迹聚合物,研究其对贝母素甲、贝母素乙和贝母辛分子的吸附性能,然后将分子印迹聚合物用于流动注射化学发光分析中,建立了分子印迹-化学发光新方法用于贝母药材中贝母素甲、贝母素乙、贝母辛的生物活性成分的分析检测,为从贝母药材中高效分离富集贝母生物碱活性组分提供了一种新方法。本论文主要研究内容包括如下五个部分:1、运用微波-超声波协同萃取技术对暗紫贝母鳞茎中总生物碱的提取工艺条件进行优化。在单因素实验基础上,选取液料比、提取混合溶剂体积比、微波功率和提取时间作为变量因素,根据Design-expert软件中心组合原理设计4因素3水平的响应曲面分析法,依据回归分析建立生物碱提取率模型并实践验证,得到微波-超声波协同萃取暗紫贝母鳞茎中总生物碱最佳提取工艺为:用3倍体积量的氨水浸泡暗紫贝母鳞茎粉末3 h,提取时间11 min、液料比31:1(mL g-1)、氯仿-甲醇体积比为3.3:1、微波功率300W,在此条件下,得到暗紫贝母总生物碱的含量为0.1062 mg.g-1。该方法简单、萃取效率高,为贝母生物碱的提取应用提供了科学理论依据。2、采用硅胶柱色谱及Sephadex LH-20纯化技术对暗紫贝母的化学成分进行了研究,从暗紫贝母的乙醇提取物中分离得到多个化合物,运用理化性质和核磁共振光谱1HNMR、13CNMR及高分辨质谱鉴定了15个化合物的结构,其中生物碱类化合物6个,分别为:peimine(1),peiminine(2),peimisine(3),petilidine(4),puqiedinone(5),imperialine(6);甾醇及核苷类化合物9个,分别为:β-sitosterol(7),daucosterol(8),sitoindoside 1(9),uracil(10),thymine(11),guanosine(12),uridine(13),adenosine(14),thymidine(15)。其中化合物petilidine和sitoindoside Ⅰ首次从暗紫贝母中分离得到。3、采用分子印迹技术合成了对贝母素甲分子有高度选择性的贝母素甲分子印迹聚合物,通过红外和电镜手段对印迹聚合物进行表征,同时通过Scatchard模型研究印迹聚合物对贝母素甲分子的选择吸附性能。通过静态吸附实验结果表明,该分子印迹聚合物对贝母素甲具备良好的吸附能力。以该印迹聚合物作为分子识别物质,利用高锰酸钾-甲醛-贝母素甲化学发光体系,建立了测定贝母素甲的具有高选择性的分子印迹-化学发光分析法。方法的线性范围为5.0 × 10-7～5.0 × 10-5 mol·L-1,检出限为2.0× 10-7mol·L-1,对3.0× 10-6mol·L-1的贝母素甲溶液进行11次平行测定,测得相对标准偏差为3.6%。本法已成功应用于贝母药材中贝母素甲的分析检测,结果令人满意。4、以贝母素乙为印迹分子,分别用环氧树脂,聚乙二醇和二乙烯三胺作为功能单体、致孔剂和交联剂,通过逐步聚合反应,制备了贝母素乙分子印迹聚合物,并用Scatchard方法详细分析了印迹聚合物对贝母素乙的吸附机理。把该印迹聚合物放置在流动注射化学发光仪的通路中,创建了一种新型的流通式贝母素乙的分子印迹化学发光传感器,用于测定贝母属类植物中的贝母素乙,并优化了传感器的发光条件。结果表明,该发光传感器测定贝母素乙的线性范围为4.0 × 10-5～2.0 ×10-3 mol·L-1,检出限为3.0×10-6mol·L-1,11次平行测定的相对标准偏差为2.3%。此方法可成功应用于川贝母、浙贝母和暗紫贝母中贝母素乙组分的在线检测。5、用同样的印迹技术通过逐步聚合法合成了贝母辛分子印迹聚合物,通过Scatchard方法考察了贝母辛分子印迹聚合物和非印迹聚合物对贝母辛分子的选择吸附性能。研究结果表明,贝母辛分子印迹聚合物对贝母辛的吸附选择性能明显高于非印迹聚合物,将该印迹聚合物用于流动注射化学发光中,选择鲁米诺-过氧化氢-氢氧化钠化学发光体系,制备了贝母辛分子印迹化学发光传感器,优化了传感器的发光条件。发光传感器测定贝母辛的线性范围为1.0 × 10-5～1.5 × 10-3 mol·L-1,检出限为1.5×10-6mol.L-1,11次平行测定的相对标准偏差为2.9%,实现了对于贝母属类植物中贝母辛组分高灵敏、高选择性的检测。