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背景炎症是导致肿瘤发生发展的重要因素。炎性信号诱导的NF-κB信号通路在调节细胞增殖、转化和肿瘤发生发展中起重要作用。深入研究转录因子NF-κB的下游调控机制,有助于发现抑制炎性信号作用下肿瘤发生发展的分子靶点。课题组前期研究发现并报道了间质特异性叉头框转录因子F2(Forkhead box F2,FOXF2)异位表达于具有间质细胞特性的基底样乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)细胞,而在非BLBC细胞中不表达或低表达;FOXF2抑制BLBC转移但促进细胞增殖;FOXF2通过抑制EMT转录因子抑制BLBC转移。迄今,FOXF2调控乳腺癌细胞增殖的机制尚无研究报道。为了研究FOXF2在乳腺癌细胞中异位表达的调节机制,我们利用生物信息学分析发现FOXF2启动子区存在多个NF-κB(RELA/p65和p50亚单位)的转录结合域,推测FOXF2是NF-κB的转录调控靶基因。基于文献报道NF-κB信号通路在BLBC细胞中呈激活状态,而在非BLBC细胞中为非激活或低激活状态,推测NF-κB信号通路可能调节FOXF2在乳腺癌细胞中的亚型特异性表达,并通过激活FOXF2的转录,调节乳腺癌细胞的生物学行为。目的本研究旨在阐明NF-κB对FOXF2的转录调控作用,以及FOXF2介导NF-κB调节乳腺癌细胞增殖的机制。研究结果将丰富对炎性信号调节乳腺癌生物学特性及发生发展分子机制的理论认识,并有助于发现诊断和治疗乳腺癌的新策略.方法1.以Luminal亚型乳腺癌细胞系MCF-7和T47D及basal-like亚型乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT549为研究对象,分别采用促炎因子TNF-α诱导FOXF2低表达的MCF-7、T47D和BT549细胞激活NF-κB信号通路,采用Nuclear Factor NF-Kappa-B Inhibitor Kinase Beta(IKKβ)抑制剂TPCA1处理高表达FOXF2的MDA-MB-231抑制NF-κB信号通路。采用Western、RT-QPCR检测FOXF2表达量变化,确定NF-κB对FOXF2的调控作用。2.在数据库中查找转录因子NF-κB在FOXF2启动子上的结合位点并用Ch IP实验进行验证。在MDA-MB-231中抑制NF-κB信号通路,在MCF-7中激活NF-κB信号通路,同时与对照组进行比较,观察NF-κB的结合位点在通路激活或者抑制状态下有无变化。双荧光素酶报告系统进一步检测NF-κB在FOXF2启动子上的结合位点处有无转录激活作用。3.探究FOXF2是否能够促进乳腺癌细胞系增殖,以乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-231、BT549为研究对象进行MTT、平板克隆形成实验。4.探究FOXF2介导NF-κB信号通路促进乳腺癌细胞增殖的机制。在MCF-7中过表达FOXF2,在MDA-MB-231中降表达FOXF2,Western检测Cyclin D1的表达量变化;MCF-7、MDA-MB-231中分别激活或者抑制NF-κB信号通路,IP实验检测Rel A与FOXF2在蛋白水平的结合作用;Ch IP实验检测Rel A与FOXF2在Cyclin D1启动子上的结合作用。5.双荧光素酶报告系统检测FOXF2对NF-κB转录活性的影响,确定FOXF2对Rel A的辅助调节作用。结果1.以Luminal亚型乳腺癌细胞系MCF-7和T47D及basal-like亚型乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT549为研究对象,分别采用促炎因子TNF-α诱导FOXF2低表达的MCF-7、T47D和BT549细胞激活NF-κB信号通路,采用IKK-β抑制剂TPCA1处理高表达FOXF2的MDA-MB-231抑制NF-κB信号通路。采用Western、RT-QPCR检测FOXF2表达量变化,发现激活NF-ΚB之后FOXF2的表达量显著升高,抑制NF-κB通路活性之后FOXF2的表达量显著降低。2.Ch IP实验检测NF-κB在FOXF2启动子上的结合位点,MCF-7细胞在不受TNF-α刺激的条件下,FOXF2的启动子上仅存在一个NF-κB结合位点,并且结合微弱。TNF-α刺激MCF-7细胞激活NF-κB信号通路,在FOXF2的启动子上出现多个Rel A的结合位点;MDA-MB-231在不受任何刺激的情况下,FOXF2的启动子上存在多个Rel A结合位点,加入NF-κB信号通路抑制剂TPCA-1,Ch IP实验发现Rel A在FOXF2启动子上的结合位点消失。双荧光素酶报告系统检测NF-κB对FOXF2启动子的转录激活作用,发现在MCF-7中激活NF-κB信号通路或者过表达Rel A,FOXF2的转录活性增强;在MDA-MB-231中抑制NF-κB信号通路,FOXF2的转录活性降低。以上实验结果说明激活的NF-κB信号通路在转录水平上调控FOXF2的表达。3.用乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-231、BT549进行MTT、平板克隆形成实验,发现FOXF2能够介导NF-κB信号通路促进乳腺癌细胞的增殖。4.MCF-7、MDA-MB-231中分别过表达或者干扰FOXF2,Western、RT-QPCR检测Cyclin D1的表达量变化。发现在MCF-7中过表达FOXF2,能够在一定程度上促进Cyclin D1的表达,在MDA-MB-231中干扰掉FOXF2则显著抑制Cyclin D1的表达;在MCF-7中激活NF-κB信号通路同时降表达FOXF2,在MDA-MB-231中抑制NF-κB信号通路同时过表达FOXF2,发现FOXF2能够逆转NF-κB信号通路对Cyclin D1的调节作用;IP实验发现NF-κB信号通路处于激活状态时Rel A与FOXF2存在结合作用;Ch IP实验发现FOXF2与Rel A共同结合在Cyclin D1的启动子上,并且Rel A转录促进Cyclin D1表达的过程需要FOXF2的辅助调节。5.双荧光素酶报告系统检测FOXF2对NF-κB转录活性的影响,发现FOXF2能够增强NF-κB的转录活性。结论NF-κB信号通路能够通过RELA/p65直接转录激活FOXF2表达;FOXF2通过与RELA/p65结合,作为p65的辅转录因子转录促进Cyclin D1的表达;NF-κB信号通路与FOXF2形成正反馈调节环驱动乳腺癌细胞增殖。