辽宁省番茄灰霉病菌对腐霉利抗药性机制及快速检测技术研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 11次 | 上传用户:mumuww
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灰霉病是当前设施蔬菜生产中的的重大威胁。辽宁省一直以来都是我国的蔬菜的种植大省,在辽宁全省范围内对灰霉病进行研究和防控,对保障蔬菜的正常生产和维护农民利益具有重要的现实意义。本论文以番茄灰霉病为主要研究对象,调查检测了辽宁省地区番茄灰霉病病菌对腐霉利的抗药性现状,而后以对腐霉利产生抗药性的番茄灰霉病病菌菌株为试验素材,鉴别抗性菌株与敏感菌株之间生物学特性上的差异性,并对抗性分子机制进行了研究,寻找分子水平上的差异性,并最终依据这种差异性,利用LAMP方法,建立了快速检测番茄灰霉病病菌对腐霉利的抗药性的分子检测技术,为实现田间抗药性的监测与管理提供一定的技术手段。辽宁省各地区番茄灰霉病菌对腐霉利的抗性菌株已较为普遍,抗药性呈现加重趋势。从辽宁省盘锦、葫芦岛、朝阳、丹东、法库、阜新、普兰店、沈阳等八个地区采集分离的115株番茄灰霉病菌菌株中,抗性菌株96株,抗性频率83.48%。沈阳、盘锦、葫芦岛、朝阳四个地区的抗性频率都高达90%以上。而且,在盘锦和阜新各检测发现1株高抗菌株。辽宁省不同地区间番茄灰霉病菌对腐霉利的抗药性有所差异,但系统聚类分析表明,辽宁省番茄灰霉病菌对腐霉利的抗药性与菌株采集地之间并无明显联系。辽宁省番茄灰霉病菌对腐霉利的抗、感菌株之间在生物学特性上存在一定的差异。番茄灰霉病对腐霉利的抗、感菌株的最适生长温度均为20 ~oC或25 ~oC,对温度敏感性相同。且在相同温度条件下,不同番茄灰霉病菌菌株之间的菌丝生长速度、产孢量以及孢子萌发率存在一定差异,但这与菌株是否对腐霉利具有抗药性没有关系。但在经药剂处理后的菌丝、孢子及孢子梗等微观形态上,番茄灰霉病菌的腐霉利抗、感菌株的表现有所不同。抗性菌株在微观形态上趋于正常,而敏感菌株则多表现畸形。而且在致病力上,相较于番茄灰霉病菌对腐霉利敏感菌株,其抗性菌株有所降低。辽宁省番茄灰霉病菌对腐霉利的抗性菌株在BcOS1基因上存在突变位点。运用PCR等手段,成功获得各菌株的BcOS1基因片段。通过碱基序列比对发现,在所有番茄灰霉病菌菌株样本中,腐霉利敏感菌株的BcOS1基因未检测到突变位点的存在,而在腐霉利抗性菌株中则检测到两个突变位点,即BcOS1基因的第369位和第373位,抗性菌株存在两种基因突变类型:Q369P和Q369P+N373S。进一步对各突变类型菌株数目和分布地点进行分析发现,辽宁省番茄灰霉病菌对腐霉利抗性菌株的突变类型与采集地之间存在一定的关联性,不同地区的突变类型有所不同。辽宁省番茄灰霉病病菌对腐霉利抗性菌株的LAMP检测方法得以建立。在对辽宁省番茄灰霉病菌对腐霉利抗性分子机制研究的基础上,以抗性菌株DNA为模板,设计了LAMP检测体系的特异性引物,并对LAMP反应体系进行优化,最终确定腐霉利抗性菌株检测的最佳LAMP反应体系。并通过随机选取的抗性菌株对所建立的LAMP反应体系进行进一步的验证,最终所建立的LAMP反应体系可将番茄灰霉病菌对腐霉利的抗性菌株和敏感菌株成功区分,适用于番茄灰霉病菌腐霉利抗性菌株(Q369P)的检测。
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