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目的:探讨结直肠癌的表观遗传学发生发展机制,包括:1、检测结直肠癌中的多基因甲基化状况,寻找在结直肠癌特异性甲基化的基因谱;分析多基因甲基化与结直肠癌临床病理学特征及预后之间的关系,探讨多基因甲基化作为结直肠癌分子标记的依据;2、探讨结直肠癌中多基因甲基化与蛋白表达之间的关系;3、探讨错配修复基因hMLH1启动子甲基化与结直肠癌错配修复缺陷表型――高度微卫星不稳(MSI-H)和hMLH1蛋白表达缺失之间的关系。方法:1、甲基化特异的PCR检测65例结直肠癌[包括39例散发性结直肠癌、26例家族性非息肉病性结直肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC),含有36例11～46个月、平均38个月术后随访资料]、8例结直肠腺瘤、16例癌远端粘膜和1例正常结肠粘膜中, 32个CpG岛位点[包括30个基因启动子CpG岛及2个肿瘤甲基化(methylated in tumor, MINT)位点]的甲基化状态;2、组织芯片免疫组织化学检测58例结直肠癌(病例同前,包括34例散发性结直肠癌、24例HNPCC)中,甲基化程度不同的11个基因的蛋白表达;3、选择国际HNPCC合作小组推荐的标准微卫星位点,单核苷酸重复序列Bat25和Bat26位点,应用GeneScan分析62例结直肠癌(病例同前,包括37例结直肠癌、25例HNPCC)的微卫星不稳定性。结果:第一部分:1、32个检测位点中共有22个检出甲基化,甲基化率3%～100%。每例结直肠癌、腺瘤及远端粘膜均检出至少7个以上位点甲基化。p21WAF1、p27KIP1、CDH1、RASSF1c、TIMP3、VHL、DNMT1、BRCA1、DAPK和PTEN等10个位点未检出甲基化;2、结直肠癌中检出全部22个位点甲基化,腺瘤-远端粘膜-正常粘膜甲基化位点数递减,分别为18、13和4个(正常粘膜仅N33、SFRP1、MAGEA1和COX2出现甲基化)。甲基化指数(methylation index, MI)增高与年龄大于65岁、左半结肠癌有关(均p<0.05); 3、ER(100%)、MGMT(20%)、hMLH1(18%)、p16INK4a(15%)、APC(8%)、p14ARF(6%)、RASSF1a(3%)、MINT1(15%)和MINT31(11%)等9个位点甲基化仅出现于结直肠癌及腺瘤而未出现于远端粘膜,显示肿瘤相对特<WP=5>异性。散发性癌MGMT(26%)、hMLH1(23%)、p16INK4a(18%)甲基化率高于HNPCC(分别为0%、10%、和10%),MINT31甲基化率(10%)低于HNPCC(30%);4、61.5%结直肠癌、62.5%腺瘤出现MGMT、hMLH1、p16INK4a、p14ARF、APC、RASSF1a、MINT1和MINT31等7个位点中任意一个甲基化,散发性结直肠癌中年龄大于65岁者检出率(83.3%)明显高于年龄小于65岁者(52.3%)(p=0.04);5、MGMT(20%) 、p14ARF (6%)、RASSF1a(3%)和 MINT31(11%)等4个位点甲基化仅出现于癌而没有出现于腺瘤,33.8%结直肠癌可检出其中任意一个位点甲基化,年龄大于65岁的病例检出率(54.5%)明显高于年龄小于65岁者(23.3%)(p=0.015);6、p16INK4a甲基化与低分化(43% vs 8%)和散发性右半结肠癌(45% vs 7%)有关(p<0.05);7、散发性结直肠癌15.4%(6/39)同时出现MGMT、hMLH1、p16INK4a、p14ARF、APC、RASSF1a、MINT1和MINT31中3个以上甲基化记为CpG岛甲基子表型阳性(CpG island methylator phenotype, CIMP+),均为发生淋巴结转移的病例,与低分化有关(36% vs 2%, p<0.05);8、结直肠癌低分化和CDH13未甲基化的病例术后生存概率明显降低(p<0.01)。第二部分:1、CDH13启动子甲基化与蛋白表达减少有关(p<0.05),散发性癌和 符合Bethesda标准 (BG组)HNPCC中hMLH1启动子甲基化与蛋白表达减少有关(p<0.05),符合Amsterdam和日本标准(AC&JC组)HNPCC hMLH1启动子甲基化与蛋白表达减少无关;2、结直肠癌中未甲基化的基因CDH1和TIMP3在结直肠癌高表达(分别98%和79%),结直肠癌中全部甲基化的基因ER未检出蛋白表达,cyclin A1、RARβ、COX2、p14ARF和MGMT蛋白表达未显示与启动子甲基化状态有关;3、CDH13、hMLH1蛋白表达减少的病例有术后生存概率较高的趋势;第三部分:1、检出高度微卫星不稳(microsatellite instability high, MSI-H) 结直肠癌10例,占全部病例的16% (10/62),其中散发性癌2例(5.4%, 2/37),HNPCC 8例(32%, 8/25),均非CIMP+;2、MSI-H与各位点甲基化率无统计学相关关系;3、在2例散发性MSI-H结直肠癌中1例(50%)出现hMLH1启动子甲基化,伴蛋白表达缺失;5例MSI-H而以往没有检出错配修复基因突变的HNPCC中,1例(20%)出现hMLH1启动子甲基化,伴蛋白表达缺失;4、hMLH1蛋白表达减弱或缺失的散发性癌中hMLH1甲基化占50%(5/10),HNPCC中hMLH1甲基化占22%(2/9)。散发性癌hMLH1甲基化率高于HNPCC,但差异未达显著性;5、结直肠癌MSI-H与年龄小于65岁(p=0.02)、早期癌(p=0.025)、hMLH1蛋白表达缺失有关(p=0.014),与各检测位点甲基化状态、MI、CIMP均无关(p>0.05);6、MSI-H病例有术后生存概率大于MSS病例的趋势。结论:第一部分:1、检出MGMT、hMLH1、p16INK4a、p14ARF、APC、MINT1和MINT31等7个位点是结直肠肿瘤相对特异的甲基化谱,61.5%结直肠癌有至少<WP=6>其中一个位点甲基化,老年病人多见;2、MGMT、p14ARF、RASSF1a和MINT31是结直肠癌特异性甲基化谱,33.8%结直肠癌有至少其中一个位点甲基化,老年病人多见;3、老龄、左半结肠发生和低分化是与多基因甲基化关系比较密切的结直肠癌临床病理学特征;4、结直肠癌CDH13未甲基化病例术后生存概率?