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脂肪酶(Triacylgycerol acylhydrolase, Lipase, EC3.1.1.3),是一类水解酶,广泛存在于植物种子,动物组织及微生物体中。能催化长链脂肪酸甘油酯水解为长链脂肪酸和甘油。黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药及前体化合物的合成和手性化合物的拆分等方面有广泛的用途。获得高效表达黑曲霉脂肪酶的基因工程菌是该酶工业化生产的前提。本文以毕赤酵母分泌表达能提高目的蛋白表达量为研究目标,对黑曲霉脂肪酶基因进行了优化设计、合成并在毕赤酵母中进行了表达,主要工作包括以下内容：1、根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对已有的黑曲霉脂肪酶基因lip的带信号肽序列的基因和成熟肽基因5’端的99个氨基酸进行突变,并合成突变引物。以原有的基因为模板PCR扩增得到突变基因的序列,与pPIC9K构建重组表达载体pPIC9K-lipm和pPIC9K-lipm-27,并在毕赤酵母GS115中进行分泌表达,摇瓶水平诱导酶液经SDS-PAGE检测表明有蛋白表达,但检测其酶活性较低。2、从Genbank已登录的黑曲霉脂肪酶基因(GenBank Accession No. DQ647700)出发,对lipA基因进行生物学分析。分析表明该基因全长1044bp,编码一个348氨基酸的多肽,其中编码成熟肽基因序列长894bp,编码298氨基酸成熟肽。其中(G+C)%含量为55.59%,密码子第三位GC碱基含量为66.1%。按P.pastoris密码子偏爱性,密码子分析显示基因中RSCU值<0.3的密码子数量为190个,占整个基因密码子的63.7%。对lipA基因mRNA分析表明,lipA基因mRNA折叠后最小自由能△G=-293.74kcal/mol。确定优化方案设计lipA基因,并人工合成lipAm基因。根据毕赤酵母密码子偏爱性,去除黑曲霉脂肪酶基因中酵母表达低频率密码子,替换为酵母高频密码子,获得能在毕赤酵母中高效表达的黑曲霉脂肪酶基因lipAm,并在合成基因的5’端加入EcoR I酶切位点,3’端加入Not I酶切位点,以便基因转入表达载体pPIC9K中。3、经人工合成及序列测定以后,构建了优化黑曲霉脂肪酶基因酵母表达载体pPIC9K-lipAm及pPIC9K-lipAm。经Sal I线性化后,电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,经MD和MM平板筛选、PCR检测获得阳性重组酵母,实现了lipAm基因在酵母中的分泌表达。结果表明,摇瓶水平诱导120h后,其优化后的lipAm基因重组酵母酶活为优化前酶活的5倍。