肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其导致的死亡为全球所有癌症导致死亡的第3位。在亚洲和非洲,乙肝感染是导致肝癌的主要原因。肝癌患者大多是在慢性肝病的基础之上发展为肝癌。因此,对于肝癌的治疗应该既要针对肝癌也要针对慢性肝病。手术切除依然是目前肝癌患者获得长期生存的主要手段,然而手术切除对于肝癌病人来说并不意味着治愈,因为术后还有较高的复发转移率。转移复发已成为影响肝癌患者术后长期生存的主要障碍。目前研究发现肝癌术后的复发可分为早期复发和晚期复发,早期复发是指根治术后2年之内的复发,被认为是由原发肿瘤播散所致；晚期复发是指根治术后2年之后的复发,被认为是再生的肿瘤。显然,这两种类型的复发需要不同的干预策略。而将两类不同原因导致的复发区分开是实施相应干预策略的基础。遗憾的是目前还没有有效的分子标记物能将早期复发和晚期复发区分开。因此,发现区分早期复发和晚期复发的标记物成为了一项紧迫的任务。microRNA是一类长约18-22nt的非编码RNA,它们通过与1mRNA的3’UTR结合达到转录后调控的目的,从而影响基因的表达。microRNA的失调广泛存在于乙肝感染及恶性肿瘤等很多人类疾病中,研究也表明这种失调可能参与了恶性肿瘤的发生、发展,有人甚至认为microRNA的失调是恶性肿瘤的特征之一microRNA已被发现在癌症发生的多个步骤中以癌基因或者抑癌基因的形式参与其中。此外,microRNA的失调也可能成为疾病诊断、治疗甚至预后相关的分子标记物。而且有研究发现用microRNA对恶性肿瘤进行分型较mRNA更准确。因此,本研究拟通过TaqMan Low-Density Array (TLDA)筛选出在乙肝感染及肝癌中差异表达的microRNA及与肝癌早期复发相关的microRNA并在此基础之上探讨其作为分子标记物的可能,并为下一步其在疾病发生、发展中所起作用的功能研究及进一步发展相应的治疗策略奠定一定的基础。第一部分乙肝患者血清中及肝癌患者FFPE样本中显微切割肝细胞microRNA实时定量PCR内参基因的研究本研究通过从TLDA分析中筛选出候选microRNA,后在更多样本中用实时定量PCR验证以明确乙肝患者血清中及肝癌患者石蜡样本中显微切割肝细胞microRNA实时定量PCR研究中合适的内参基因,并分析肝脏特异性的microRNA-miR-122在乙肝患者血清及从石蜡样本中显微切割的肝细胞中的表达。我们分别将10例乙肝患者及10例健康人血清等体积混合抽提总RNA后用TLDA检测后挑选出与其均数相近的microRNA,在52例乙肝患者血清及57例健康人血清中检测这些microRNA和目前被用做循环microRNA内参的基因,并用geNorm和NormFinder软件分析出最合适的内参基因组合。用实时定量PCR技术在乙肝患者血清及显微切割的乙肝感染肝细胞和正常肝细胞中检测miR-122的表达。结果发现：miR-26a、miR-22*和miR-221是乙肝患者血清：microRNA实时定量PCR研究最合适的内参基因组合。miR-122在乙肝患者血清中显著升高。而用同样的方法我们发现miR-103和miR-191是从福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin embedded, FFPE)肝癌样本中显微切割的肝癌细胞及癌周非癌肝细胞中：nicroRNA实时定量PCR研究最合适的内参基因组合。第二部分乙肝及肝癌患者血清及FFPE组织中差异microRNA的研究本研究采用激光捕获显微切割9例乙肝患者肝组织石蜡样本中的肝细胞、8例无肝炎病毒感染的肝细胞、24例肝癌FFPE样本中癌细胞及癌周非癌肝细胞并提取总RNA。在乙肝感染的肝细胞和无肝炎病毒感染的肝细胞间检测miR-122的表达,而在癌细胞及癌周非癌肝细胞间检测差异表达的microRNA。然后,在乙肝及肝癌患者血清中检测肝癌细胞与癌周非癌肝细胞差异表达microRNA的表达并分析其差异。探讨肝癌患者石蜡样本中显微切割的癌细胞和癌周非癌肝细胞中差异表达的microRNA及这些差异microRNA在乙肝及肝癌患者血清中的表达情况以及乙肝感染肝细胞与无肝炎病毒感染肝细胞中miR-122表达的差异情况。结果发现miR-22*、miR-26a及miR-122在肝癌细胞中的表达显著低于癌周非癌肝细胞,而仅有miR-22*在肝癌患者血清中表达较乙肝患者高,其余microRNA在两组间无差异表达。miR-122却在乙肝感染的肝细胞中显著降低,与乙肝感染患者血清中miR-122的改变趋势相反。第三部分FFPE组织中肝癌早期复发相关microRNA的研究本研究通过TLDA筛选出与肝癌早期复发相关的microRNA,并在大样本中验证该结果,然后探讨其与肝癌预后的关系及作为肝癌早期复发预测分子标记物的可能。我们分别将10例显微切割肝癌细胞及10例癌周非癌肝细胞的总RNA等浓度混合后用TLDA检测后挑选出在早期复发及无早期复发组之间差异表达的microRNA,在训练组(106例)及测试组(112例)中检测差异：microRNA的表达。并分析其与肝癌预后的关系及其作为肝癌早期复发分子标记物的研究。结果发现肝癌细胞中的miR-29a*在早期复发组较无早期复发组显著高表达,且高表达miR-29a*者有较短的至复发时间。结论1. miR-26a、miR-22*及miR-221是乙肝患者血清microRNA实时定量PCR研究最合适的内参基因组合,U6作为乙肝患者血清microRNA实时定量PCR研究的内参基因可能错误解释实验结果。2. miR-122在乙肝患者血清中较健康人显著高表达,而miR-122在乙肝感染的肝细胞中则较健康肝细胞显著低表达。肝细胞中某些microRNA的异常可能在血清microRNA中存在相反趋势的改变。3. miR-103及miR-191是乙肝相关肝癌患者显微切割FFPE样本中microRNA实时定量PCR研究最合适的内参基因组合,而let-7a作为乙肝患者血清microRNA实时定量PCR研究的内参基因可能会错误解释实验结果。4. miR-22*, miR-26a, miR-122在显微切割的肝癌细胞中的表达水平显著低于癌周非癌肝细胞。miR-22*在乙肝患者血清中的表达水平显著低于肝癌患者血清中的水平。5.肝癌细胞中的miR-29a*可能是预测肝癌患者术后早期复发的分子标记物。创新点1.首次报道了miR-26a、miR-22*及miR-221是乙肝患者血清microRNA实时定量PCR研究最合适的内参基因组合,而U6并不适合作为乙肝患者血清microRNA实时定量PCR研究的内参基因。2.首次报道了在人组织及血清中miR-122的反向变化关系。3.首次报道了miR-103及miR-191是乙肝相关肝癌患者显微切割FFPE样本中microRNA实时定量PCR研究最合适的内参基因组合,而let-7a并不适合作为乙肝患者血清microRNA实时定量PCR研究的内参基因。4.首次报道了1miR-22*在肝癌患者血清中的表达显著高于乙肝患者血清中的表达。5.首次报道了miR-29a*在早期复发的肝癌细胞中高表达,及其可能成为早期复发的分子标签。潜在应用价值1.肝癌细胞中miR-29a*的表达水平可以预测肝癌患者的预后。2.对miR-29a*在肝癌早期复发中机理的研究可能为预防肝癌患者根治术后早期复发提供新的干预策略。3.血清中miR-22*可能可以用于肝癌的诊断。4. miR-29a*可能单独或联合其他指标成为预测肝癌患者根治术后早期复发的预测指标。