目的:1.观察兔激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of femoral head,SIONFH)模型自然修复过程中骨小梁空间结构参数的变化以及改建方式。2.观察活血祛瘀法对兔激素性股骨头坏死修复的影响。3.评价体外Micro-CT和体内高分辨率磁共振(HRMRI)检测动物模型骨小梁空间结构改变的一致性。4.观察药物作用下模型坏死骨周围组织细胞因子的变化,分析活血祛瘀法对成骨-破骨偶联的调控。5.评价临床上活血祛瘀法治疗SIONFH疗效,观察骨小梁空间结构参数变化及骨小梁改建方式,剖析"活血祛瘀法"防治激素性股骨头坏死塌陷的作用机理。方法:1.第一部分,评价活血祛瘀法对兔激素性股骨头坏死修复的影响:50只健康的成年新西兰大白兔,将其随机分入模型组、中药组和空白组,其中模型组和中药组各20只,空白组10只。内毒素(LPS)联合甲强龙(MPS)按照LPS×1(10μg/kg)耳缘静脉注射结合MPS×6(40mg/kg)肌肉注射制作兔激素性股骨头坏死模型。中药组使用《医宗金鉴》方桃红四物汤按照兔与人等效剂量灌胃处理。分别于第2、4、8、12周行HE染色和HRMRI、Micro-CT检测,观察坏死及修复情况。HRMRI最小空间分辨率≤0.03mmm,Micro-CT最小空间分辨率≤0.035mm,设定骨小梁成像结构参数,比较HRMRI和Micro-CT在测量股骨头坏死骨小梁改建过程中的作用。在上述相同时间点,利用Western Blot技术检测兔股骨头RANK、RANKL、VEGF、OPG、RUNX2、0PN、ABCB1、PPARγ蛋白表达水平。2.第二部分,讨论活血祛瘀法防治人股骨头坏死塌陷的作用机理:参照《成人股骨头坏死诊疗标准专家共识(2012年版)》及《股骨头坏死诊断与治疗的专家建议》的诊断标准,筛选自2011年12月～2014年10月,于广州中医药大学第一附属医院骨关节科就诊并符合纳入标准的SIONFH病例共36例64髋。其中双侧发病28例,男性20例,女性16例。年龄20～50岁,平均35岁。患者就诊时出现关节疼痛的时间为2～24周,平均17周。签署知情同意书,经医院医学伦理委员会批准后入组。每3个月行双髋正、蛙位X线检查,分别测量记录股骨头发生塌陷时间和塌陷高度。每6个月行HRMRI平扫,测量骨小梁相关空间结构参数。在治疗前、服药3个月、服药6个月、服药1年、服药2年,分别记录患者Harris评分。随访时间14～38个月,平均为27个月。基于患者的HRMRI影像资料,利用Mimics 13.1医学影像控制系统重建坏死区、硬化区的三维结构;利用图像处理软件ImageJ评价承重区冠状面坏死面积和硬化区面积在股骨头纵切面中的比值。通过表观骨小梁空间结构改变,分析活血祛瘀法防治股骨头坏死塌陷的作用机理。结果:1.SIONFH造模评估:40只新西兰大白兔,中药组(n=20)与模型组(n=20)同时注射内毒素后,48h内共死亡7只,33只存活,存活率82.5%。模型组共14只出现坏死征象,坏死发生率为82.4%(14/17);中药组5只出现坏死征象,坏死发生率为 31.3%(5/16)。2.组织学观察:兔股骨头切片HE染色显示:模型组:软骨面皱褶,骨小梁显著较正常组稀疏,局部骨小梁断裂,骨细胞核固缩,大量空骨陷窝形成,骨髓脂肪细胞堆积;正常组:骨小梁结构完整,空间排布规则,小梁内的骨细胞清晰可见,空骨陷窝的数量较少,骨髓中存在丰富的造血细胞,脂肪细胞含量相对较少,且形态正常;中药组:骨小梁相较正常组稀疏,形态尚可,成骨细胞活跃。4周时模型组空骨陷窝率为(17.24±1.08)%,正常组(5.33±0.96)%,差异有统计学意义(P<0.05),中药组4周时组织学观察与模型组无明显差异,8周及12周检测可见成骨细胞活跃,骨小梁形态较前完整,空骨陷窝率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.HRMRI扫描分析:T1WI可见模型组股骨头内存在明显低信号带;中药组在股骨头内近骨骺处存在小斑片样低信号改变,但大部分骨组织的灰度值正常。HRMRI结构参数分析结果显示,模型组与正常组相比,前者的ROE值(即坏死水肿区面积)增加,ROE/NR比例升高,中药组与模型组相比,中药组的ROE值减少,ROE/NR的比例下降,差异有统计学意义(P<0.05),提示活血祛瘀法可促进激素性股骨头坏死修复。4.Micro-CT扫描分析:在各时间节点分别取各组兔左侧股骨头行Micro-CT检测,表观可见模型组骨小梁较正常组稀疏,部分断裂。中药组与模型组相比,骨质改善,骨小梁存在局部性修复。Micro-CT检测发现,模型组与正常组相比,前者BV、Conn.D.、SMI、Tb.N、Tb.Th 值降低,BV/TV 比例下降,BS/BV、SMI、Tb.Sp 值升高。中药组与模型组相比,前者BV、Conn.D.、SMI、Tb.N值升高,BV/TV比例增加,BS/BV、Tb.Sp、Tb.Th值下降,差异有统计学意义(P<0.05)。5.SIONFH 相关蛋白检测:Western blot 检测 RANK、RANKL、ABCB1、RUNX2、VEGF、OPN、PPAR γ、OPG的蛋白表达。与模型组相比,中药组RUNX2、OPG表达上调而RANK、RANKL表达下调(P<0.05),而模型组相较于正常组,其RANK、RANKL、RUNX2蛋白均上调,OPG蛋白表达下调,差异有统计学意义(p<0.05);与模型组相比,中药组的ABCB1蛋白表达上调,差异有统计学意义(p<0.05),而模型组ABCB1的蛋白表达相较正常组下调,差异有统计学意义(P<0.05);相对于正常组,模型组内VEGF的蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。相对于模型组,中药组VEGF的蛋白上调,差异有统计学意义(P<0.05)。各组间OPN和PPAR y的蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。6.临床病例疗效评价:本研究36例患者64髋中,42髋与治疗前相比,坏死水肿区面积减小(42/64)。至随访2年,未塌陷29髋中8髋塌陷,塌陷率27.6%(8/29),塌陷时间3个月～14个月,平均塌陷时间8.7个月。其中塌陷<2mm者4例;2mmm～4mm者3例;>4mm者1例。治疗前、服药3个月、6个月、1年、2年Harris评分分别为:81.5±10.8、83.7±9.1、87.3±4.7、87.5±7.8、79.4±5.2。其中服药6个月、1年与服药前相比差异有统计学意义(P<0.05)。7.三维重建MRI表现与临床症状相关性分析:股骨头坏死中坏死体积、坏死病灶总表面积、坏死体积比、承重坏死区面积与Harris评分呈负相关(r=0.171,P<0.05;r=0.288,P<0.05;r=0.452,P<0.01;r=0.452,P<0.01)。硬化区体积、承重硬化区面积与Harris评分呈正相关(r=-0.321,P<0.01;r=0.452,P<0.01)。结论:1.活血祛瘀法治疗兔SIONFH后,HRMRI及Micro-CT显示,兔股骨头内坏死骨小梁结构改建优于自然修复,说明活血祛瘀法能够改善SIONFH影像学表现。病理切片HE染色显示,在12周结束时3组病理改变差异有统计学意义(P<0.05),说明活血祛瘀法能够促进兔SIONFH修复,12周时趋于修复完全。2.2周时HRMRI即出现坏死征象,并经过病理验证坏死发生,同期Micro-CT未出现骨小梁形态及骨密度明显改变。实验表明,HRMRI与Micro-CT作为高分辨率影像技术均能有效评价活血祛瘀法治疗兔SIONFH疗效,但HRMRI对股骨头坏死诊断要早于Micro-CT,与临床实践相符合。3.Micro-CT显示,中药组相较于模型组BV、Conn.D.、SMI、Tb.N值升高,BS/BV、Tb.Sp值降低,但Tb.Th值下降。说明活血祛瘀法治疗可增高骨密度,促进修复,但未能使骨量明显增加。4.中药组相较于模型组,除RANK、RANKL表达水平下调外,其余均为上调;而模型组与正常组相比,RANK、RANKL、RUNX2的蛋白表达上调,OPG、ABCB1、VEGF的蛋白表达下调。说明活血祛瘀法促进坏死修复的机制可能与抑制RANK、RANKL表达,促进 ABCB1、OPG、VEGF、RUNX2 表达有关。5."活血祛瘀法"可改善未塌陷SIONFH患者Harris评分,维持髋关节基本功能。同时三维重建MRI表现与临床症状相关性分析显示:股骨头坏死中坏死体积、坏死病灶总表面积、坏死体积比、承重坏死区面积与Harris评分呈负相关;硬化区体积、承重硬化区面积与Harris评分呈正相关。硬化面积的扩大能够促进头内微结构的重新平衡,增加结构稳定性,提高患者Harris评分。