高通量发掘新型杀虫蛋白基因平台的建立

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:scsnlaosi
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苏云金芽胞杆菌在其形成芽胞的同时,能产生一种或多种伴胞晶体蛋白,部分伴胞晶体蛋白对特定的一种或多种昆虫幼虫具有特异性的毒杀活性。该特性使苏云金芽胞杆菌被成功地开发为微生物杀虫剂用于害虫的防治;同时,该菌也是转基因作物的主要基因来源。基于苏云金芽胞杆菌开发的产品的广泛使用引发了人们对于昆虫抗性产生的担忧,而新的伴胞晶体蛋白基因的克隆是克服昆虫抗性的主要途径之一;同时,也是拓展其杀虫谱、应付主要害虫消亡伴随的次生害虫形成的重要手段。同时,了解苏云金芽胞杆菌与昆虫之间的相互作用有助于我们更好地了解他们之间的关系,从而更好地控制昆虫。本研究主要从以上两个方面开展工作,并取得了如下研究成果:  1)建立了一套快速、高效、经济的从苏云金芽胞杆菌菌株中挖掘新的伴胞晶体蛋白基因的新策略。该策略的建立主要基于两个方面,即采用第二代测序技术快速、经济、高通量地获取混合的质粒富集的基因组DNA序列;采用在本研究中构建的计算学管道BtToxin_scanner从上述序列中识别潜在的伴胞晶体蛋白基因。本研究构建的BtToxin_scanner算法整合了三种比较成熟的算法,包括BLAST、隐马尔可夫(HMM)和机器学习方法(SVM),来预测cry基因的存在。采用两个数据集对BtToxin_scanner的检验结果发现其具有快速(蛋白质和开放阅读框序列的平均处理速度为1.02MB/min;核苷酸序列的平均处理速度为1.80MB/min)、灵敏和特异等特点。为了使更多的研究者能够使用该 cry基因预测算法,我们建立一个伴胞晶体蛋白基因预测的网站,其网址为:http://bcam.hzaubmb.org/BtToxin_scanner;  2)根据苏云金芽胞杆菌菌株的质粒图谱和/或伴胞晶体的形态,选取本实验室搜集的21株菌株进行分析。分别对这些菌株进行质粒富集的DNA的抽提,混合后进行Illumina测序。从测序拼接得到的序列中分析得到143条潜在的伴胞晶体蛋白基因序列。根据这些序列的长度及其与已知伴胞晶体蛋白基因编码的氨基酸序列的一致性,选取27条序列进行克隆,获得8个全长cry基因。将这8个基因提交苏云金芽胞杆菌δ-内毒素命名委员会,其中,5个基因已获正式命名(cry8Ac1,cry7Ha1,cry21Ca1,cry32Fa1,cry21Da1),而其他三个基因由于其编码的氨基酸序列与已知cry基因编码的氨基酸序列一致性低于45%而未获命名;  3)完成苏云金芽胞杆菌YBT-1520四个不同生长阶段的转录谱分析,初步完成了该芯片的数据分析工作;此外,开展苏云金芽胞杆菌YBT-1520感染棉铃虫条件的确定以及采用差异裂解法抽提感染样品中YBT-1520的总RNA,结果表明,先采用SDS差异裂解消除宿主细胞再抽提YBT-1520的总RNA,其质量和总量均无法满足芯片实验的要求,因此需进一步完善总RNA的抽提方法。  
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