基于纳米材料的荧光分析方法由于具有简便、快捷、易操作、灵敏等优点,在化学分析、生物传感、疾病检测、环境监测等方面具有潜在的应用前景。目前,在结合纳米材料设计的荧光分析方法中,大多是采用共价修饰的方式将纳米材料与靶向识别配体交联在一起去实现目标物的分析检测。而共价修饰费时、费力的多步化学实验过程使得荧光纳米分析方法复杂化,且有可能影响靶向识别配体的特异识别能力。近年来,由DNA为模板制备的荧光银纳米簇具有小尺寸、无毒副作用和光稳定性好,尤其是生物相容性好等优点使其成为热点研究的荧光纳米材料之一。同时,在生物化学分析领域中有很多目标分析物与DNA具有特异的相互作用(如,金属离子Hg2+与DNA的T碱基形成“T-Hg2+-T”复合结构、Ag+可以与DNA的C碱基形成“C-Ag+-C”的复合结构、K+和Pb2+等能够诱导富G的DNA序列形成G-四聚体结构等),尤其是随着SELEX技术的飞速发展,越来越多的物质(从小分子、蛋白到细胞、细菌等)都拥有了能与其产生特异识别的核酸适配体aptamer,这在根本上拓展了分析检测目标物的范围,为化学分析研究提供了有力工具。基于此,针对大多数结合纳米材料的荧光分析方法多步化学修饰费时费力的问题,本论文试图开拓一种新型免标记荧光分析方法的设计研究思路,利用DNA对目标物的特异识别能力结合DNA稳定的荧光银纳米簇巧妙设计一条寡聚核苷酸链既能够实现目标物的识别又可以完成荧光银纳米簇的制备、或者通过DNA与目标物之间的相互作用而促使银纳米簇产生荧光信号的变化、或者由目标物促发DNA分子机器产生信号放大的效果而以DNA稳定的荧光银纳米簇作为信号读出等机制发展一系列免标记荧光分析方法用于重金属离子、小分子及细胞等目标分析物的检测研究,主要开展了以下研究工作：一、基于DNA银纳米簇结合DNA分子机器放大效应的荧光探针用于汞离子的免标记高灵敏检测该方法利用"T-Hg2+-T"复合结构和放大作用的DNA分子机器结合DNA稳定的荧光银纳米簇发展了一种免标记的汞离子荧光检测方法。一条设计合理的DNA序列为复印机式的DNA分子机器提供了基本骨架,由三个关键部分组成：含T碱基的汞离子识别序列、银纳米簇模板序列互补的序列以及限制性内切酶特异识别位点的碱基序列。仅当存在汞离子时,含T碱基的汞离子识别序列通过"T-Hg2+-T"复合结构形成发夹型结构,在聚合酶和dNTPs存在时,从发夹型末端双链部分开始进行寡聚核苷酸的复制过程,由于限制性内切酶特异位点的存在,复制好的寡聚核苷酸链在限制性内切酶特异识别位点处被切开,下一轮的聚合过程会将产物序列从分子机器上替换下来。不断重复的聚合、切刻、替换的过程可以产生大量的产物片段DNA,而该产物DNA被设计成荧光银纳米簇的模板DNA,再以该产物DNA为模板合成荧光银纳米簇,基于银纳米簇的荧光强度实现了水中汞离子浓度的定量。实验结果显示,该方法能够对水中低至0.08nM的汞离子实现灵敏检测,而其他金属离子没有影响。二、基于DNA稳定的银纳米簇的新型荧光探针用于铅离子的免标记特异检测该方法基于DNA稳定的荧光银纳米簇发展了一种新型、特异、灵敏检测Pb2+的免标记荧光探针。基于Pb2+能够选择性淬灭DNA稳定银纳米簇在靠近富含鸟嘌呤碱基序列后增强的荧光信号的实验现象,我们设计了一条富含胞嘧啶的DNA序列用来制备弱荧光信号的银纳米簇,该弱荧光信号的银纳米簇能够通过靠近富含鸟嘌呤的DNA序列来增强其荧光信号,当Pb2+存在时,这种明亮的荧光银纳米簇的荧光信号将会被淬灭,基于此,实现了Pb2+的定量检测。在优化的检测条件下,该方法对Pb2+的检测下限达到5nM,并且具有较好的选择性,是一种新型的铅离子免标记荧光检测手段。三、基于DNA稳定的银纳米簇结合ATP依赖的核酸连接反应构建的新型荧光探针用于ATP的免标记高特异检测DNA稳定银纳米簇的荧光对于其模板DNA的碱基序列是具有依赖性的,同一条DNA链中,一定数目的鸟嘌呤能够显著增强富含胞嘧啶序列为模板制备的银纳米簇的荧光信号。基于此,利用DNA稳定的银纳米簇以及高度依赖ATP为辅酶因子的连接反应发展了一个新型免标记的荧光探针能够特异、灵敏的检测小分子ATP。该设计方案为：一条作为银纳米簇模板的富含胞嘧啶的序列和一条富含鸟嘌呤的序列同时与同一条DNA互补杂交形成由三条DNA序列构成的DNA双链结构,T4DNA连接酶在辅酶因子ATP存在时能够将富含胞嘧啶的序列与富含胞嘧啶的序列之间的缺口连接并形成一条DNA结构,使用该序列为模板能够制备出荧光信号强烈的银纳米簇,通过对银纳米簇的荧光进行分析检测,进而实现ATP的检测。由于ATP是该连接酶反应高度依赖的辅酶因子,所以该策略具有非常好的选择性,能够有效区分ATP的类似物,结合免标记银纳米簇强烈的荧光信号,本策略为ATP的分析检测提供了灵敏、特异的新方法,并且为该类型生物分子检测提供了新的研究思路。四、基于DNA稳定银纳米簇一步构建DNA-AgNCs-Aptamer探针用于肿瘤细胞特异性分析研究灵敏、特异的检测肿瘤细胞不仅对于癌症的早期检测而且对于癌症转移以及治愈后追踪都具有非常重要的研究意义。该工作拟发展一个采用一步法构建的银纳米簇-aptamer探针并实现简单、特异的荧光标记靶肿瘤细胞。这个方案的构建依赖于单条寡聚核苷酸结构的设计,要求该单条寡聚核苷酸链既可以完成银纳米簇的制备又可以实现靶肿瘤细胞的特异性识别。我们选用了相应的核酸适配体用于识别靶细胞和富含胞嘧啶的核酸序列用于制备荧光银纳米簇。考虑到核酸适配体与靶细胞结合时需要一定的空间利于其识别构象的完成,我们在核酸适配体和富含胞嘧啶的核酸序列之间插入一段连接臂,这样的结构设计有利于靶细胞的识别和荧光银纳米簇和制备。首先,选择CCRF-CEM及其aptamer sgc8c作为模式研究对象,通过优选合适的连接臂,用一步法构建强烈荧光信号的aptamer(sgc8c)-AgNCs探针,使其与靶肿瘤细胞CCRF-CEM孵育,实验结果显示,该荧光探针对靶细胞具有很好的特异识别能力。为了进一步研究该设计的普遍适用性,我们用Ramos细胞的aptamerTD05采用类似的设计原理构建了aptamer(TD05)-AgNCs探针,进一步证实了一步法构建的银纳米簇-aptamer探针具有很好的普遍适用性。该探针设计方案是简单、廉价、一步完成,无需额外的生物识别分子与荧光团之间的共价交联步骤,为肿瘤细胞的荧光标记提供了新方法。五、基于识别杂交介导的荧光银纳米簇免标记"turn-on"式aptamer-荧光探针用于肿瘤细胞分析检测通过将特异识别介导的aptamer构象变化、构象变化导致的核酸杂交以及银纳米簇靠近富含鸟嘌呤序列而显著荧光增强的特性巧妙地结合在一起,发展了一种免标记、"turn-on"模式的荧光aptamer策略用于肿瘤细胞的分析检测。这个方法的实现主要依赖于两条巧妙设计的寡聚核苷酸序列,一条是含有识别靶肿瘤细胞的aptamer序列、用于增强银纳米簇荧光的富含鸟嘌呤寡聚核苷酸序列的和一个臂端序列(称之识别探针),另一条是含有用于银纳米簇制备的模板序列以及一个臂端序列(称之信号探针)。由于aptamer识别并结合靶细胞后发生构型变化,进而引发了信号探针臂端序列与识别探针臂端序列的杂交,导致银纳米簇靠近富含鸟嘌呤序列而使得荧光信号显著增强,从而可以实现靶肿瘤细胞的"turn-on"模式免标记检测。该方法免除了细胞洗脱或者分离等实验步骤,具有简便、快速、灵敏等特点,为肿瘤细胞免标记检测提供了新的设计理念。为了证明这一原理设计的可行性,选择肿瘤细胞CCRF-CEM以及其aptamer sgc8c来构建实验体系,实验结果显示该方法不仅能够有效地对CCRF-CEM实现特异识别和荧光成像,而且能够通过流式细胞仪检测到200μL缓冲溶液中低至150个的CCRF-CEM细胞。同时,我们还选择肿瘤细胞Ramos及其aptamer TD05构建了实验体系,充分展示了该方法的通用性。