糖用栽培甜菜(Beta Vulgaris L)是二年生作物，通常情况下第一年进行营养生长，第二年经春化后块根发芽、抽苔、开花、结实。但是，由于某些原因也可见到甜菜当年抽苔的现象。在甜菜生产及育种试验田中，甜菜当年出现抽苔、开花、结实植株统称为当年抽苔植株。由于该植株把大量光合产物消耗于生殖生长过程，影响块根增长和糖分积累，致使块根产量比正常甜菜产量减少10％～20％，含糖率降低0.8％～1.6％，工艺品质差，不耐贮藏，抽苔越早，减产越多，含糖量降低越显著。严重影响甜菜的生产并给育种试验结果带来很大的误差，因此有必要分析甜菜抽苔的原因，采取相应的抗抽苔措施。分析引起甜菜当年抽苔的原因，国内外研究认为遗传与环境因素都能影响甜菜抽苔。可分为内因和外因。具体地说，内因是由控制甜菜一年或二年生习性的基因决定的，而外因则是生态条件即当年能满足其生殖生长的环境条件，那么就会出现当年抽苔的现象，该条件主要是春化和光周期：即低温和长日照。此外营养条件、激素水平等也影响甜菜当年抽苔。无论是光周期、赤霉素还是低温这些环境条件都是外因，都要通过内因，也就是必须通过对基因的作用才能起作用。因此，要想研究二年生甜菜当年抽苔的机理，就必须分离克隆抽苔基因，弄清基因结构，表达调控等，这样才能从分子水平解释抽苔机理。本试验研究低温诱导甜菜抽苔的差异表达基因，探讨二年生甜菜当年抽苔的分子机理。主要研究结果如下：1．试验在Conviron E15型人工气候室人工控制温度、日长进行。采用马凤鸣等试验条件(长日照16h、4℃、72d，抽苔率100％)诱导“甜研材料”幼苗抽苔；采集不同时期和各处理的茎尖，提取总RNA，置换合成双链cDNA。合成3对接头引物，用代表性差示分析(Representational Difference Analysis of cDNA，cDNA-RDA)分离抽苔差异表达基因片段。将分离到的差异片段克隆，测序，获得323bp差异片段DP3序列。GenBank中的注册号为AY326073。2．根据cDNA-RDA获得323bp差异片段DP3序列，设计引物。用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)即3′-RACE和5′-RACE法进行cDNA3′端和5′端快速扩增，应用DNAMAN 4.0 Sequence Assembly程序将3′RACE和5′RACE测序结果与靶序列DP3的进行双拼接，获得693bp片段序列。3．根据RACE双拼接结果设计一对引物，以Ty7的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增回收的片段命名为Ty7Br600。将其克隆，测序，获得609bp差异片段序列。在GenBank中注册，登录号为AY324115。将获得的cDNA序列通过查询互联网，利用BlastN与GenBank库中的核苷酸序列比较，结果没有发现Ty7Br600基因同源序列；在拟南芥(Arabidopsis)的基因库中比较也未发现同源序列。因此我们认为这个cDNA序列有可能来自一个未曾分离克隆的新基因。东北农业大学农学博L学位论文 4.分别以’fy7和TA33的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增回收的片段分别命名为7少7/]1夕夕奸11荆.丈价厂600。将其克隆，测序，分别获得6Ogbp和855bp基因片段序列。通过国际互联网在GenBank中注册，厅朋z认匆DNA登录号为AY3241 14。别刃功，彬夕登录号为AY324113。应用DNAMAN4.osequenceAlignment程序将cDNA差异片段Ty夕召尹‘ooeDNA和珍7B四卯基因组DNA序列比较发现有1个235bP的内含子(iniron)，其左边界为GT，右边界为AG，与通常植物基因中的内含子边界一致。与别刀B巧00基因组DNA序列比较发现，一年生(当年抽苔)品种的TA33 Br600基因组DNA序列没有内含子，另外，二者同源性为99.8%，只有在513处有l个碱基差异。这种单核普酸的微小变化，可能与一年生品种TA33当年抽苔机制有关。 5.综合DNAMAN、PHD、sosul软件、GLOBE等儿种软件预测结果，可以推测妙7B巧00基因编码部分的蛋白可能是一种分子量约为15KD，等电点PI为5.85，具有紧凑的球状膜蛋白(eompaet，globular，nembrane protein)· 6.对厅刀介万夕口基因进行RT一PCR分析，结果表明，低温诱导72天的甜菜幼苗，取出6小时后有较弱表达，至4S小时达到最高，72小时后稍有减弱。因此，厅刀介石口口基因是一种诱导表达型基因。分别用。一32P一A1，P放射标记按随机引物标记法标记探针，进行Northem杂交。Northem杂交实验结果显示，在低温诱导培养的甜菜幼苗的RNA群体中，出现较强的杂交条带，而在未诱导培养的甜菜幼苗的RNA群体中，则儿乎没有阳性杂交条带出现。因此，这一序列有可能是二年生甜菜幼苗经低温诱导处理之后被诱导表达的与抽苔相关的新基因序列。Southern杂交结果发现，在每一组酶切中至少有2~3条条‘{1李，且有1条带的强度明显高于其他条带，表明这些cDNA差异片段确为甜菜基因组片段，也同时表明该基因在甜菜基因组中以2个拷贝或低拷贝形式存在。 7.构建原核表达载体，转化JM109菌株，IPTG诱导蛋白表达，SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳检测。结果电泳图谱上出现清晰的诱导表达条带，外源蛋白的表达量占细菌总蛋白的12%左右，融合蛋白相?