血清I型马立克氏病病毒(Marek’s disease virus serotype 1,MDV-1)的UL49基因和UL13基因分别和单纯疱疹病毒I型的UL49及UL13基因同源,各自编码大小约27.6kDa和57.1kDa大小的蛋白,在HSV-1中,这两种蛋白均为主要的被膜蛋白。VP22被发现在不存在其他病毒蛋白的情况下具备蛋白转导的功能,并且目前已经有很多研究表明VP22能够转运其它蛋白在细胞间扩散,使其在克服基因治疗和基因免疫的缺陷方面具有得天独厚的优势。而UL13作为病毒自身编码的丝/苏氨酸蛋白激酶,在病毒复制、组装、以及调节宿主细胞转录翻译方面发挥着重要作用。在HSV中,VP22是UL13的主要病毒蛋白底物,并且有研究发现VP22的磷酸化可能影响该蛋白的定位,而在MDV中还未有类似报道。目前关于MDV VP22及UL13的研究相对较少,究竟MDV VP22是否也能作为蛋白转运的工具?又有哪些蛋白能够被该蛋白转运?MDV VP22的转运功能是否能够增强机体针对目的蛋白的免疫应答水平?VP22的转导特性又如何?在MDV中,UL13是否能够磷酸化VP22?该磷酸化修饰对VP22又有何影响?这些都需要进一步的实验进行探索。本研究旨在通过对上述问题的探索,为VP22进一步走向应用打好基础。1. VP22转运异源蛋白的研究MDV VP22具有独立的蛋白转导功能,能够在细胞间高效转导,为进一步探索该蛋白作为蛋白转运工具的可行性,本研究构建了GFP、AIV-NP、BoIFN-γ、IBDV-VP2以及NDV-F基因与MDV-1 VP22融合表达的重组质粒,并将所获得的重组质粒在COS-1上进行瞬时表达以观察上述不同融合蛋白在COS-1细胞上的定位情况,从而评价VP22对这4种蛋白的转运能力。结果发现GFP、AIV-NP及BoIFN-γ在与VP22融合表达的状态下能够被VP22高效转运,而VP22对NDV-F的转运效率较低,对IBDV-VP2则完全不具备转运能力。此外,被VP22转运后的蛋白均定位在细胞核内。这些研究结果说明MDV VP22能够作为蛋白转运的载体,但对所转运蛋白具有选择性,并且VP22能够改变被转运蛋白原始的细胞定位。2. VP22增强机体针对目的抗原免疫应答水平的评价MDV VP22蛋白具备蛋白转运的功能,能够转运与VP22融合表达的GFP、AIV-NP、BoIFN-γ以及NDV-F等蛋白,为进一步评价VP22对这几种蛋白的免疫增强效果,本研究将pNP-VP22、pBoIFN-γ-VP22及pF-VP22的重组表达融合蛋白的质粒免疫Balb/c小鼠,4免后采取小鼠血清并分离小鼠淋巴细胞,通过ELISA、ELISPOT以及流式细胞法检测各组小鼠的免疫应答水平,结果发现,VP22能够特异性增强BoIFN-γ的细胞免疫水平,而对其体液免疫没有多大的影响。相反,NP蛋白的体液免疫水平却显著增强,但细胞免疫增强的效果不明显。而对于F蛋白,VP22几乎对其无任何的免疫增强的效果。上述结果显示,MDV-1 VP22具备增强机体针对目的抗原的免疫应答的功能,但免疫应答的类型可能会受到VP22蛋白转运方式的影响。3. VP22转导机制的研究MDV VP22蛋白具有独立的蛋白转导功能,能够作为蛋白转运的工具,但其转导及细胞定位的机制还未确定。我们早期的研究发现,在MDV感染的CEF中,VP22定位于细胞核,为进一步研究该蛋白的转导机制及细胞定位机理,分析该蛋白在表达过程中细胞定位的影响因素,本研究通过重组人腺病毒表达VP22蛋白,并对重组病毒表达的VP22的转导功能进行鉴定,结果发现将重组病毒感染的AD-293细胞裂解产物加至正常的MDBK细胞上,VP22能够进入几乎所有的细胞,说明重组病毒表达的VP22蛋白具有很强的蛋白转导功能。进一步鉴定VP22的细胞定位发现,在重组病毒感染的AD-293细胞中,VP22首先聚集于细胞核周围,随后以特殊的荧光粒子的形式散在于胞浆中,有别于AD-293细胞中瞬时表达的VP22及MDV感染的CEF中VP22的定位模式;同时我们也对Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的VP22的蛋白转导特性以及VP22转导的细胞广谱性进行了研究,发现该系统表达的VP22也具有蛋白转导的功能,并且其定位可能受到温度的影响,而瞬时表达的VP22的转导是细胞广谱性的,能够在多种细胞上实现蛋白转导的功能,并且定位在细胞核内。4. MDV-1 UL13序列对比分析及对VP22可能的磷酸化位点预测蛋白激酶是一类庞大的蛋白家族,尽管它们的结构、催化模式以及特异性底物都存在很大的差异,但它们的功能结构域却相当保守。MDV UL13是病毒编码的蛋白激酶,本研究通过DNAStar软件的MegAlin功能对比MDV不同毒株以及不同疱疹病毒属的UL13氨基酸序列,发现MDV不同毒株的UL13序列近乎相同,而不同疱疹病毒属的UL13及相应同源物的同源性很低,但在它们的激酶结构域内保守。通过CDTree软件绘制该蛋白的遗传分类图谱,发现它与黑腹果蝇的pelle蛋白的功能结构域属于相同进化分支,利用NCBI protein Blast功能检索MDV UL13保守结构域,发现MDV UL13也具有丝/苏氨酸蛋白激酶的激酶结构域,并且催化中心主要位于152-297氨基酸残基间,利用Cn3D 4.1软件分析Blast结果,建立UL13可能的结构模型,同时对比真核生物蛋白激酶的基序,发现UL13在激酶SubdomainⅦ的保守甘氨酸残基被丝氨酸替代,SubdomainⅧ的保守非极性脯氨酸残基被极性半胱氨酸残基替换。利用NetPhos 2.0 Server对VP22进行磷酸化位点预测,发现该蛋白存在多个丝/苏氨酸磷酸化位点,且主要集中在两端,提示MDV VP22很有可能也是UL13的磷酸化底物。5. UL13的原核和真核表达以及多抗血清的制备MDV UL13蛋白是病毒自身编码的蛋白激酶,具有类似真核细胞蛋白激酶的功能,并且在整个疱疹病毒科内都具有保守性,为研究该蛋白激酶的功能,本研究通过PCR方法从CVI988疫苗株基因组中扩增UL13基因,并将UL13基因片段克隆到杆状病毒转移载体pFastTMBac1中,再将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经过转座和蓝白菌落筛选及PCR鉴定,获得含UL13基因的重组穿梭载体。在脂质体的辅助下将重组穿梭载体转染Sf9细胞,通过PCR验证获得含UL13基因的重组杆状病毒,命名为rBac-UL13。同时,利用GENEART(www.gcua.de)分析UL13在大肠杆菌中表达时密码子的偏嗜性;通过DNAstar抗原性分析确定UL13的高抗原性片段,进行原核表达,并以切胶免疫方法免疫小鼠制备多抗血清,再以获得的多抗血清检测rBac-UL13重组毒感染的sf9细胞,证实了所获多抗血清含有特异性针对UL13的抗体,同时也证实了UL13在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达。