人工合成β寡糖调控天然免疫应答分子机制的研究蘑菇和灵芝等作为食物和药物在中国应用已久,中国传统医学将其应用于疾病的预防和治疗。目前研究发现从不同机体如细菌、真菌、植物和其他的有机体提取的多糖具有良好的免疫调节效应,它能够与宿主细胞如巨噬细胞和树突状细胞表面的选择性受体(如dectin-1)相互作用,从而激活巨噬细胞和树突状细胞的功能产生相应的免疫应答。在香菇和灵芝等的提取物中发现了很多活性物质,具有广泛生物学功能,香菇多糖就是其中一种重要的生物活性物质,具有免疫调节活性和抗肿瘤活性,能够调节巨噬细胞和树突状细胞的功能。香菇多糖通过上调巨噬细胞和树突状细胞MHC分子和协同刺激分子的表达,增强巨噬细胞和树突状细胞的成熟和活化从而发挥抗原递呈功能,同时也能够促进巨噬细胞和DC分泌细胞因子,发挥免疫调节作用和抗肿瘤作用。多糖和寡糖在抗炎症反应和抗自身免疫性疾病方面也有很多的报道,研究发现多糖具有抗炎作用,抑制炎症因子表达,促进抗炎因子表达等作用,并且能够保护机体免受免疫反应造成的损伤。鉴于多糖和寡糖的广泛生物学功能和免疫调节作用,其在药物设计和疫苗研究方面多有应用。目前报道发现香菇多糖发挥抗肿瘤活性与其结构和分子量相关,香菇多糖主链形成三螺旋构象对于其发挥生物学功能具有重要的作用,以β-(1→6)连接为主链,β-(1→3)连接为侧链的β寡糖是香菇多糖的一个基本结构单位,被认为是香菇多糖发挥抗肿瘤作用的重要结构,实验中发现人工合成的以β-(1→6)连接为侧链,β-(1→3)连接为主链的β寡糖及其主链含有α-(1→3)连接的β寡糖类似物具有和天然提取的香菇多糖相似的抗肿瘤作用,能够促进脾细胞的增殖和肿瘤坏死因子(TNF-α)的分泌。由于目前应用的大部分多糖都是植物或动物以及其他物种的提取物,存在结构不确定性,纯度不高以及产量较少的问题,而实验发现合成的多糖基本结构单位和多糖具有相似的生物学效应,而且人工合成的寡糖具有结构明确,纯度高和产量高等优点,因此人们基于这些多糖的基本结构单位人工合成寡糖并观察其生物学功能。在本实验中,顾建新教授课题组基于香菇多糖和其他β多糖的基本结构,人工合成了主链包含有一个α-(1→3)连接的,以β-(1→6)连接为侧链,β-(1→3)连接为主链的六聚体β寡糖,我们研究了人工合成β寡糖对小鼠腹腔巨噬细胞成熟活化及其细胞因子表达的调节；以HT29细胞,人外周血单个核细胞和单核细胞为模型,初步探讨了人工合成β寡糖对人源免疫细胞功能调节的机制；并观察了人工合成β寡糖对树突状细胞成熟活化及其细胞因子表达的调节。一.人工合成β寡糖对小鼠腹腔巨噬细胞成熟活化及其细胞因子表达的调节1.人工合成β寡糖对小鼠腹腔巨噬细胞表面分子和炎症相关细胞因子表达的影响人工合成β寡糖处理小鼠腹腔巨噬细胞,FACS检测发现细胞表面受体CD40表达上调,而CD86及MHCI, II分子没有明显变化。CD40是重要的协同刺激分子,在激活T细胞的免疫应答方面起着重要的作用,提示p寡糖有利于巨噬细胞发挥其抗原呈递功能。用Real-Time PCR检测寡糖处理细胞后炎症相关细胞因子的转录水平,发现IL-12, IL-6的表达有不同程度的上调(未处理组的2.5-2.7倍),而IL-10表达下调(未处理组的1/5)。ELISA检测细胞培养上清发现,TNF-α, IL-6和IL-12分泌增加,IL-10分泌减少。TNF-α是抗感染和炎症反应中巨噬细胞的一个重要调节因子,而且在抗肿瘤方面具有重要的作用。IL-12是重要的T细胞活化因子,能够刺激T细胞和NK细胞生成IFN-γ和TNF-α,并且减少工L-4介导的IFN-y的抑制。IL-10是重要的抗炎因子,在调节巨噬细胞的功能方面起着重要作用,主要由Th2类免疫细胞分泌,它能够抑制巨噬细胞的功能。这些结果提示人工合成β寡糖能够通过调节炎症因子和抑炎因子的分泌调节巨噬细胞的功能。为了进一步研究人工合成p寡糖对小鼠巨噬细胞分泌免疫调节相关细胞因子的影响,我们用Mouse Cytokine Array Panel A检测了调节细胞间相互作用的趋化因子及细胞因子等细胞外信号分子。结果显示,β寡糖对CCL1,CCL2,CCL3, CCL4, CCL5,CCL12, CXCL10, TIMP-1, G-CSF, KC, CD54, MIP-2, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-16, IL-17, IL-23, IL-1ra, IFN-γ和TNF-a的分泌有明显的促进作用。为探讨人工合成β寡糖在发挥免疫调节功能时的作用机制,我们用p寡糖处理小鼠腹腔巨噬细胞,定量PCR芯片技术检测与炎症及自身免疫相关细胞因子,发现β寡糖处理前后部分趋化因子及其受体、部分白介素家族成员及其受体等基因表达有差异,其中有38个细胞因子的变化具有统计学意义(上调18个,下调20个)。进一步分析与这些细胞因子表达相关的转录因子,找到39个转录调节因子,其中7个是MAPK信号通路上的重要因子,与MAPK信号通路的活化有密切关系。同时,分析这7个转录因子所对应的与炎症及自身免疫相关细胞因子,我们发现了以下几个重要的细胞因子：Tnfs14,其主要作用是促进T细胞增殖,触发肿瘤细胞凋亡;Nos2,诱导型一氧化氮合酶,在抗微生物和抗肿瘤反应中发挥重要的生物学作用；CCR6,在炎症反应时调节树突状细胞和T细胞的迁移与募集。2.人工合成β寡糖发挥免疫调节作用相关细胞信号转导通路的研究Western Blot检测发现,人工合成β寡糖能够增强小鼠腹腔巨噬细胞MAPK通路上关键蛋白ERK的磷酸化水平,对其上游活化因子c-Raf的磷酸化也有上调作用。当巨噬细胞ERK磷酸化被抑制时,p寡糖对巨噬细胞细胞因子转录的调节也消失；当β寡糖促进巨噬细胞ERK磷酸化的作用恢复后,可以观察到其对细胞因子转录的调节。通过检测PI3K/AKT通路上关键蛋白的磷酸化水平,发现人工合成p寡糖抑制了AKT蛋白Thr308位点和Ser473位点的磷酸化。同时,寡糖上调AKT信号通路上游抑制因子PTEN磷酸化和受AKT磷酸化负调控的GSK-3p的磷酸化,并且下调AKT信号通路上游活化因子PDK-1的磷酸化。3.人工合成p寡糖发挥免疫调节作用相关受体和信号通路的研究分别用TLR-2, TLR-4和Dectin-1的抗体预处理小鼠腹腔巨噬细胞,然后用人工合成β寡糖处理细胞,Western Blot分别检测MAPK和PI3K/AKT信号通路上关键蛋白磷酸化水平,实验发现寡糖对ERK磷酸化上调作用与TLR-2和Dectin-1受体相关,而对AKT蛋白磷酸化的抑制只与Dectin-1受体相关。ELISA检测细胞培养上清中细胞因子的分泌,发现当TLR2被阻断后,用β寡糖处理的细胞上清中TNF-α和IL-6分泌量比未处理组的量明显减少,IL-10的分泌量明显增加。TLR-4被阻断后,用寡糖处理的细胞上清中TNF-α, IL-12和IL-10的分泌量与未处理组相比没有明显变化,IL-6分泌量则明显减少。当Dectin-1受体被阻断后,用β寡糖处理的细胞的上清中TNF-α和IL-12分泌量比未处理组的量明显减少。结果提示实验中使用的人工合成β寡糖对巨噬细胞分泌细胞因子的影响有可能和TLR2, TLR4和Dectin-1受体有关。二.人工合成β寡糖对人单核细胞细胞因子表达调节及其信号转导通路的影响IL-18是IL1细胞因子超家族中的一员,是IFN-γ产生的主要诱导因子之一,在调节机体免疫反应中起着重要作用,能够调节天然免疫应答和获得性免疫应答,而且也是一个能够在不同的免疫环境中调节Th1或Th2类免疫应答的细胞因子。除了这些作用以外,IL18也参与到慢性炎症反应和自身免疫性疾病当中。β寡糖分别处理HT29细胞和人单核细胞,通过Real-time PCR检测IL-18、IL-18BP、TIR8等细胞因子的表达,发现在HT29细胞和人单核细胞中,β寡糖能够能够增强IL-18BP的表达,并提高IL-18BP/IL-18的比例。文献报道过量表达TIR8能够抑制IL-18作用,我们的研究中却发现β寡糖对人单核细胞表达TIR8起抑制作用。为进一步证实人工合成β寡糖对人PBMC/PBM细胞间相互作用的趋化因子及细胞因子等细胞外信号分子的调节作用,我们用Human Cytokine Array Panel A检测了细胞培养上清中趋化因子及细胞因子的分泌情况。结果显示在PBMC中,寡糖能够促进CCL5, CXCL1, MCP-1, MIF, MIP-lalpha和IL-6的分泌。在单核细胞中,经β寡糖处理后,趋化因子CCL5, CXCL1, MCP-1, MIF, MIP-lα, IL-8分泌增加；细胞因子IL-6, TNF-a和IL-1ra分泌增加。为进一步研究人工合成β寡糖在发挥免疫调节功能时的作用机制,我们用β寡糖处理健康人外周血单个核细胞(PBMC),定量PCR芯片技术检测与炎症及自身免疫相关细胞因子,发现β寡糖处理前后部分趋化因子及其受体、部分白介素家族成员及其受体等基因表达有差异,其中有22个细胞因子的变化具有统计学意义(上调17个,下调5个)。进一步分析与这些细胞因子表达相关的转录因子,找到38个转录调节因子,其中7个是MAPK信号通路上的重要因子,与MAPK信号通路有密切关系。同时,分析这7个转录因子所对应与炎症及自身免疫相关细胞因子,我们发现了以下几个重要的细胞因子：NFATC3 (Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3),其主要作用是调节T细胞基因表达；SYK(脾酪氨酸激酶)潜在的肿瘤抑制因子；SCYE1,细胞凋亡时表达,能促进肿瘤坏死因子发挥作用。β寡糖对于这几个细胞因子的表达都具有促进作用。在人工合成β寡糖对人PBMC活化相关信号通路的研究中,我们发现β寡糖作用早期(2-4小时),细胞中ERK的磷酸化增强。同时,人工合成β寡糖能够促进人单核细胞ERK磷酸化,并且抑制(?)PI3K/AKT通路上AKT蛋白的磷酸化。三.人工合成β寡糖对树突状细胞成熟活化及其细胞因子表达的调节鉴于树突状细胞在天然免疫应答和获得性免疫应答中的重要作用,本实验观察以骨髓来源的DC作为细胞模型观察β寡糖的免疫调节作用。实验根据文献报道分离骨髓细胞,并在细胞因子IL-4和GM-CSF作用下分化为树突状细胞(MDC),通过体外细胞模型观察人工合成β寡糖对DC细胞功能的影响。β寡糖100μg/ml处理小鼠骨髓来源树突状细胞24小时,细胞表面的CD40表达指数为136.1(未处理组为123.4)；CD86表达指数为30.1(未处理组为20.6)；MHCⅠ表达指数为110.1(未处理组为60.6),MHCⅡ表达指数为8.1(未处理组为3.42)。人工合成β寡糖100μg/ml处理小鼠骨髓来源树突状细胞4小时,与未加β寡糖组相比,DC细胞TNF-a和IL-12转录水平提高,IL-10转录水平降低；β寡糖处理DC细胞48小时,与未加β寡糖组相比,细胞上清中TNF-a和IL-6分泌量增加,IL-10分泌量减少,提示β寡糖能够增强骨髓来源的DC成熟活化并调节细胞因子的表达。观察人工合成β寡糖调节DC细胞功能可能涉及的细胞信号转导通路发现,β寡糖能够增强DC细胞ERK磷酸化水平,对AKT的活化有抑制作用。前期实验发现β寡糖能够增强乙肝病毒核心抗原前144个氨基酸的质粒DNA (pB144)疫苗诱导的病毒特异性免疫应答,本部分实验观察了β寡糖对DNA疫苗诱导小鼠脾脏DC成熟的影响。实验结果发现,在初次免疫后第5天,β寡糖能够促进pB144诱导DC细胞成熟,脾脏中CD11c+CD40+、CD11c+CD86+和(CD11c+MHCⅡ+双阳性细胞数分别是未处理组小鼠的1.8-4.4倍。