肿瘤发生是遗传因素、环境因素共同作用导致细胞内信号通路失调的过程。世界卫生组织指出,人类恶性肿瘤的90％与环境因素有关。在肿瘤发生早期,环境中致癌物或非致癌物等引起细胞代谢反应失调,随后信号通路失调,最终引起遗传变异和自由生长,导致肿瘤发生。与肿瘤的发生相关的环境因素中,花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的代谢反应扮演着重要角色。　　 花生四烯酸是一种多不饱和脂肪酸,广泛存在于哺乳动物细胞膜上。当细胞受到生长因子、细胞因子等刺激时,磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)作用于细胞膜释放出AA。AA可被转化成不同种类的类花生酸物质,经三条途径被转化:细胞色素P450酶(CYP)途径、环氧合酶(COX)途径和脂氧合酶(LOX)途径,产生羟基二十碳四烯酸(HETEs)、产生前列腺素和环氧化二十碳四烯酸(EETs)等。近二十年的研究指出,AA及它的类花生酸代谢产物参与细胞内多种生理活动,如细胞增殖、血管生成、趋化过程、有丝分裂、凋亡和迁移等；它们也与多种肿瘤的发生发展有关,但具体作用机制还不清楚。　　 乳腺癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一,也是导致女性死亡的最主要因素。最近的研究表明:AA及它的代谢产物在乳腺癌的发生发展中有重要作用；病例对照和群组研究显示,在经常使用非甾体类抗炎药(non-steroidalanti-inflammatory drugs,NSAIDs)的女性中,乳腺癌的发生率较小,因为NSAIDs可以抑制COX而减少前列腺素的合成；5-LOX、12-LOX在乳腺癌组织中过度活化；在MNU诱导大鼠发生乳腺癌实验中,LOX抑制剂可以降低乳腺癌发生率；AA可以促进乳腺癌细胞增殖和迁移。但是,对于AA促进乳腺癌发生和发展的机制,目前还不清楚。　　 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(The mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种高度保守的的丝/苏氨酸蛋白激酶,属于磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3-k)相关激酶(PI3-k-related kinase,PIkk)家族。mTOR信号通路整合来自细胞内外的各种信号,调节细胞的代谢、生长增殖及存活等生理活动。mTOR在细胞内通过与其它分子形成复合物而保持生物学活性,目前认为主要有两种复合物:(1)mTORC1,由mTOR、Raptor(regulatory-associated protein ofmTOR)、mLST8/GβL(G proteinβ unit-like protein)和PRAS40组成。mTORC1能够被雷帕霉素(rapamycin,Rap)抑制,接受生长因子、营养及能量、氧应激等刺激,通过磷酸化下游底物4E—BP1(translation initiation factor4E bindingprotein1)和p70-S6K(p70 ribosomal protein S6 kinase)来调节蛋白质翻译与合成。(2)mTORC2,由mTOR、mLST8/GβL、rictor、mSin1、PRR5/Protor组成。mTORC2对雷帕霉素(rapamycin,Rap)不敏感,通过磷酸化下游底物Akt(S473)来调节生长因子信号通路。由于遗传变异或者环境因素等因为,导致PI3-k/Akt通路失调,mTOR信号通路在肿瘤发生过程中过度活化,促进了细胞增殖、生长、分化和存活。环境因素会引起代谢失调而致癌,但是代谢失调的产物是否会活化mTOR通路还不清楚,有待于研究。在我们的实验中,我们首先发现花生四烯酸(AA)可以明显激活mTORC1/2通路,并且花生四烯酸(AA)对mTOR通路的激活在乳腺癌肿瘤形成和血管生成中起重要作用。　　 1.人乳腺癌组织中花生四烯酸(AA)和PLA2含量与mTORC1/2通路信号强弱具有明显相关性　　 为了证明人乳腺癌中花生四烯酸和PLA2水平是否和mTORC1/2信号通路强弱有关,我们用免疫组化方法检测了人乳腺癌标本磷脂酶A2(phospholipaseA2,PLA2)、PS6(235/236)(mTORC1的下游蛋白)和血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)的表达量,结果以表达量低(-)(免疫组化反应分数<150)和表达量高(+)(免疫组化反应分数>150)表示。通过分析发现,PS6(235/236)与PLA2、VEGF表达量有明显相关性,具有统计学意义(P<0.001,P<0.001),PLA2表达量与VEGF有明显相关性,具有统计学意义(P<0.001)。　　 为了进一步确认花生四烯酸和PLA2水平是否和mTORC1/2信号通路强弱有关,我们用Western Blot法和ELISA法通过分析人新鲜乳腺癌标本中花生四烯酸、PLA2、VEGF、PS6(S235/236)和P-Akt(S473)(mTORC2的下游)的表达量。我们发现花生四烯酸(AA)水平与PS6(S235/236)和VEGF具有明显相关性,有统计学意义(P<0.05,P<0.05),PS6(S235/236)与VEGF、P-Akt(S473)、PLA2具有明显相关性,有统计学意义(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。除此之外,我们发现,正常组织中PLA2、VEGF、PS6(S235/236)高表达(+)百分比16.1％、25.8％、22.6％,明显低于癌组织的百分比71.0％、71.0％、80.6％,说明PLA2与PS6(S235/236)在乳腺癌的发生中有重要作用。　　 综上所述,这些结果说明人乳腺癌组织中花生四烯酸(AA)和PLA2含量与mTORC1/2通路信号强弱具有明显相关性。　　 2.花生四烯酸(AA)激活乳腺癌细胞系的mTORC1通路　　 我们的实验结果显示,在MCF-7细胞中,加入5μM/L的花生四烯酸作用30 min,可以使mTORC1下游蛋白S6、S6K1、4EBP1的磷酸化水平升高。30μM/L的AA作用5 min就可以使S6、S6K1、4EBP1的磷酸化水平升高。花生四烯酸激活mTORC1通路的现象在其他乳腺癌细胞系如Bcap37、BT549、T47D等也同样存在。加入花生四烯酸后,能够增强mTORC1体外激酶活性,使Raptor和mTORC1的结合变得松散,使mTORC1磷酸化4E—BP1(T37/46)的活性上升。Ly294002(PI3-k抑制剂)和Rap(mTORC1抑制剂)可阻断花生四烯酸对mTORC1通路的激活作用。siRNA干扰Raptor、mTOR、S6K1后,AA不能激活mTORC1通路。以上结果表明,花生四烯酸(AA)能够激活乳腺癌细胞系的mTORC1通路,并且这种激活是快速的强激活作用。　　 3.花生四烯酸(AA)活乳腺癌细胞系的mTORC2通路　　 AA可使细胞mTORC2下游蛋白Akt、GSK3β、PRAS40的磷酸化水平升高,说明AA激活了MCF-7的mTORC2通路。MCF-7细胞经30μM/L AA作用30 min可引起mTORC2下游蛋白Akt磷酸化激活,加入Ly294002后,AA对Akt的磷酸化激活效应被阻断,加入Rap后,AA对Akt仍然有磷酸化激活效应,没有被阻断,加入Pp242(mTOR抑制剂)后,AA对Akt的磷酸化激活效应被阻断。这些结果说明AA通过mTORC2通路激活.Akt。mTOR、Rictor siRNA转染MCF-7细胞后,然后加入AA作用30 min,结果发现敲低mTOR、Rictor表达水平后,AA不能使P-Akt(S473)水平上升,从根本上说明了AA能够激活MCF-7细胞的mTORC2通路。　　 4.花生四烯酸(AA)通过mTOR通路促进乳腺癌细胞增殖　　 我们检测了AA对MCF-7细胞的增殖的影响。结果显示,1μM/L及5μM/LAA能够促进MCF-7细胞的增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,100 nM/L的Rap能够抑制AA促进MCF-7细胞增殖的作用,因为Rap组与Rap+AA差异无统计学意义(P>0.05)。加入Rap阻断MCF-7的mTOR通路后,从就无法促进MCF-7的增殖,由此说明AA是通过mTOR通路促进MCF-7细胞增殖的。　　 5.花生四烯酸(AA)通过mTOR通路促进乳腺癌血管生成　　 为了确定AA是否通过激活mTOR通路促进乳腺癌血管生成,我们研究了AA和Rap对缺氧诱导因子α(hypoxia-induced factorα,HIF-α)和VEGF的影响。AA促进了MCF-7细胞HIF-α和VEGF表达,随浓度增加,作用增强；但是加入Rap和Pp242后,AA的这种促进作用被阻断,无法引起HIF-α和VEGF表达的升高。花生四烯酸可激活人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的mTORC1通路,不同浓度的AA可使细胞内S6、S6K1的磷酸化水平不同程度的升高。AA促进了HUVEC的小管形成,差异有统计学意义(P<0.05),Rap组、Rap+AA组差异无统计学意义(P>0.05),说明Rap抑制了AA对血管内皮细胞小管生成的促进作用。AA促进了鸡胚绒毛尿囊膜血管生成,差异有统计学意义,Rap组、Rap+AA组无明显差异,说明Rap抑制了AA对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的促进作用。以上结果说明了花生四烯酸(AA)通过mTOR通路促进乳腺癌血管生成。　　 6.花生四烯酸(AA)通过脂氧合酶(IJOX)激活mTOR通路、促进细胞增殖和血管生成　　 脂氧合酶(LOX)途径和环氧合酶(COX)途径是AA代谢的两个重要途径。目前已知LOX、COX在乳腺癌的发生发展中有重要作用,但是机制还不清楚。我们发现LOX抑制剂NGDA能够抑制AA对mTOR通路的激活,而COX抑制剂NS398不能,说明AA是通过LOX途径激活mTOR通路。5-HETE、12-HETE是AA经5-LOX、12-LOX途径代谢的产物,为了验证AA激活mTORC1通路是通过LOX途径,我们研究了5-HETE、12-HETE对mTORC1通路的作用。MCF-7细胞经15μM/L、30μM/L5-HETE和12-HETE作用30 min引起了mTORC1下游蛋白S6磷酸化激活,说明AA经LOX途径的代谢产物5-HETE、12-HETE可以激活MCF-7的mTORC1通路。此外,NGDA能够抑制AA对MCF-7细胞增殖和HUVEC小管形成的促进作用,而NS398不能。以上说明,花生四烯酸(AA)通过脂氧合酶(LOX)激活mTOR通路、促进细胞增殖和血管生成。　　 7.花生四烯酸(AA)通过IKK-β(IκB kinase-β)激活乳腺癌细胞的mTOR通路、促进细胞增殖和血管生成　　 据报道,ROS、GPCR、MAPK、FAK等信号通路与AA及代谢产物对乳腺癌的生物学作用有关。最近的研究表明,AA的代谢产物HETE能够激活HUVEC的NF-κB通路。为了更深入探讨AA激活mTOR通路的机制,我们研究了一些通路抑制剂对AA激活mTOR通路的影响。结果表明,Rap、Ly294002、IKKi(IKK抑制剂)能抑制AA对mTOR通路的激活,PD98059(ERK1/2抑制剂)、catalase(过氧化氢酶抑制剂)、ICI-182780(雌激素受体抑制剂)和MG132(蛋白酶体抑制剂)不能抑制AA对mTOR通路的激活。此外,我们还发现AA能增强P-IKKα/β(S176/180)的水平。siRNA干扰IKK-β后,AA不再能激活MCF-7的mTOR通路。IKKi能够抑制AA对MCF-7细胞增殖的促进作用,也能够抑制AA对HUVEC的小管形成的促进作用。说明AA是通过IKK-β来激活mTOR信号通路的。因此,花生四烯酸(AA)通过IKK-β激活乳腺癌细胞的mTOR通路、促进细胞增殖和血管生成。　　 8.花生四烯酸(从)通过mTOR通路促进SD大鼠乳腺癌肿瘤形成和血管生成　　 我们又研究了AA激活mTOR通路是否会对乳腺癌肿瘤形成和血管生成产生影响。利用N-methyl-N-nitrosourea(MNU)可以诱导SD大鼠发生乳腺癌。从肿瘤发生率来看.AA明显提高了SD大鼠乳腺癌的发生率；从肿瘤重量来看,AA组肿瘤重量大于Con组,差异有统计学意义(P<0.05)。Rap+AA组与Rap组差异无统计学意义(P>0.05),说明Rap抑制了AA促进乳腺癌肿瘤增长的作用。用Western Blot法检测了大鼠乳腺癌组织的P-S6(S235/236)水平,用ELISA法检测了大鼠乳腺癌的VEGF水平,发现AA组P-S6(S235/236)、VEGF水平均高于Con组,Rap+AA组与Rap组无明显差异。说明AA能激活大鼠乳腺癌mTOR通路,而Rap能抑制这种激活作用。这些说明花生四烯酸(AA)通过mTOR通路促进SD大鼠乳腺癌肿瘤形成和血管生成。